人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM的建立及生物学特性研究*

戢太阳，刘　娇，王燕秋，张仲林△

1.成都医学院 基础医学院(成都　610500);2.成都医学院 药学院(成都　610083)

人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM的建立及生物学特性研究*

戢太阳1，刘娇2，王燕秋2，张仲林2△

1.成都医学院 基础医学院(成都610500);2.成都医学院 药学院(成都610083)

【摘要】目的建立人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM，并研究其生物学特性。方法以人鼻咽癌细胞株CNE2为亲本细胞，采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法诱导建立多药耐药细胞株CNE2/ADM。通过观察细胞形态学变化，药物敏感性试验，测定生长曲线、群体倍增时间、细胞周期及P-糖蛋白(P-gp)功能和表达情况，评价CNE2/ADM的生物学特性。结果与CNE2细胞相比，CNE2/ADM耐药细胞异形明显，并对ADM在内的4种化疗药物产生了耐药性，增殖速度减慢，群体倍增时间延长(P<0.05)，G0/G1期细胞增多，S期、G2/M期细胞减少(P<0.05)，P-gp的药物泵出功能增强、表达水平升高。结论成功建立了人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM，其具有典型的多药耐药表型，可作为进一步研究鼻咽癌多药耐药机制及筛选逆转剂较为理想的细胞模型。

【关键词】鼻咽肿瘤；多药耐药；阿霉素；细胞株

鼻咽癌是我国华南地区发病率较高的头颈部恶性肿瘤，目前临床上对其治疗多采用放疗加化疗的综合治疗模式，化疗在鼻咽癌病人尤其晚期病例中占有重要地位。然而，鼻咽癌细胞多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生常导致临床化疗失败[1-4]，MDR已成为当前肿瘤治疗中急需攻克的难题。体外建立稳定的多药耐药细胞株对于揭示MDR机理及筛选MDR逆转剂具有重要的理论和实践意义[5-6]。本研究参考国内外文献，结合肿瘤多药耐药细胞模型培养及鉴定的标准设计实验，采用药物浓度梯度递增法建立人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM，并对其相关生物学特性进行评价，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

人鼻咽癌低分化鳞癌细胞株CNE2购自中国科学院上海细胞库。阿霉素购自大连美仑生物技术有限公司，顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司，5-氟尿嘧啶购自天津金耀药业有限公司，长春新碱购自广东岭南制药有限公司。RPMI1640培养基、胰蛋白酶、青链霉素双抗溶液购自HyClone公司。胎牛血清购自Gibco公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amresco公司。BCA蛋白定量试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自碧云天公司。罗丹明123(Rhodmine123,Rho123)染色试剂盒、ECL化学发光试剂购自凯基公司。兔抗人P-gp多克隆抗体、小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自SANTA CRUZ公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔或鼠二抗购自CST 公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及耐药细胞株CNE2/ADM的建立CNE2细胞在含10%胎牛血清及青、链霉素各100 U/mL的RPMI1640培养基中于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。采用药物浓度梯度递增法诱导建立CNE2/ADM细胞，取对数生长期CNE2细胞，以 2 nmol/mL的阿霉素浓度为首次加药浓度，作用细胞24 h后，更换无药的新鲜培养基培养，待细胞稳定生长并传代后，提高阿霉素的浓度继续诱导。如此反复换液、传代，逐步提高阿霉素浓度间歇诱导，历时约6个月，最终获得对阿霉素的耐药倍数超过亲本细胞10倍以上的耐药细胞株，命名为CNE2/ADM。倒置显微镜下观察耐药细胞和亲本细胞的形态学差异并拍照。

1.2.2MTT法检测药物敏感性取对数生长期的CNE2及CNE2/ADM细胞，调整密度为5×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，培养过夜。待细胞贴壁后，加入不同浓度的化疗药物，每个浓度设3个复孔，另设不加药物的对照孔。培养48 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL) 20 μL，继续孵育4 h后，弃去培养液，每孔加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min溶解结晶，用酶标仪检测492 nm波长处各孔吸光度D(λ)值。按公式计算细胞生长抑制率、IC50和耐药指数。抑制率=[1-加药孔D(λ)值/对照孔D(λ)值]×100%；取各浓度平均抑制率与相应的对数浓度进行线性回归，获得对数浓度对细胞抑制率的标准曲线，求出半数抑制浓度(IC50)；耐药指数(RI)= IC50(耐药细胞)/ IC50(亲本细胞)。

1.2.3细胞生长曲线和倍增时间测定分别取500 μL密度为2×104个/mL的CNE2及CNE2/ADM细胞悬液接种于24孔板常规培养。每隔24 h取3孔细胞用胰酶消化后收集，进行细胞计数，连续计数7 d。以时间为横轴，细胞数目为纵轴绘制细胞生长曲线。按照Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间td，td=t×lg2/(lgNt-lgN0)，t代表培养时间，N0及Nt分别代表起始接种时和培养到t时的细胞数。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期分别取1 mL 密度为106个/mL的CNE2及CNE2/ADM细胞悬液，420×g,离心5 min后弃上清，70%冰乙醇固定，4 ℃放置过夜，离心去上清，PBS清洗两次，加入碘化丙啶(PI)染液，37 ℃避光温浴30 min后，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测，并用CFlow Sampler Analysis 软件进行细胞DNA含量分析。

1.2.5Rho 123外排实验检测P-gp的转运功能分别取1 mL 密度为106个/mL的CNE2及CNE2/ADM细胞悬液，420×g，离心5 min后弃上清，重悬于1mL Rho123浓度为1 μg/mL的培养基中，37 ℃，5%CO2饱和湿度温箱中孵育30 min，420×g， 离心5 min后弃上清，冷PBS清洗两次，重悬于培养基中，再次孵育10 min，420×g，离心5 min后重悬于0.5 mL冷PBS液中，流式细胞仪(激发波长488 nm，发射波长530 nm)检测细胞内Rho123的荧光强度。

1.2.6Western blot 检测P-gp的表达分别收集CNE2和CNE2/ADM细胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min，于4 ℃，13 800×g，离心15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg/泳道进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜200 mA湿转2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入兔抗人P-gp多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温摇床孵育1 h，洗膜后采用ECL曝光显影，同时选β-actin作为内参。结果采用Quantity-One进行分析。

1.3统计学方法

2结果

2.1CNE2/ADM的建立及多药耐药特征

本实验采用药物浓度梯度递增法，历时6个月诱导，建立起CNE2/ADM耐药细胞株。MTT检测结果显示，CNE2/ADM对阿霉素具有显著耐药性，耐药指数为12.98，其对顺铂，长春新碱和5-氟尿嘧啶亦产生了不同程度的交叉耐药性(表1)。

2.2细胞形态及生长曲线、群体倍增时间

光镜下两种细胞均贴壁生长，CNE2细胞形态饱满，分布均匀，长满时呈铺路石样紧密排列；而CNE2/ADM细胞形态不一，边界模糊，核不规则，胞质中颗粒状物质增多，贴壁能力较CNE2减弱，传代时胰酶消化所用时间减少(图1)。CNE2/ADM较CNE2细胞生长速度减慢，二者群体倍增时间分别为(28.91±1.12) h和(21.47±2.92) h，CNE2/ADM 细胞的群体倍增时间延长，差异有统计学意义(P=0.015，P<0.05) (图2)。

表1　　　　CNE2和CNE2/ADM对不同药物的IC50

注：与CNE2相比，aP=0.002，bP=0.005，cP=0.003，dP=0.006

图1CNE2和CNE2/ADM在光镜下的细胞形态(×200)

注：A: CNE2; B: CNE2/ADM

图2CNE2和CNE2/ADM的生长曲线

2.3细胞周期分析

细胞周期分析结果显示，耐药细胞较亲代细胞的细胞周期发生改变，表现为CNE2/ADM细胞的G0/G1期分布增多，S期、G2/M期分布减少，差异有统计学意义(P<0.05)(图3、表2)。

表2　CNE2和CNE2/ADM的细胞周期分布

注：与CNE2相比，aP=0.001，bP=0.007，cP=0.004

2.4P-gp转运功能检测结果

Rho123外排实验结果显示，CNE2/ADM和CNE2细胞内Rho123荧光强度分别为(10.68±2.42)×105和(52.34±2.69)×105，CNE2/ADM细胞外排Rho123增多，差异有统计学意义(P=0.002,P<0.01)，表明CNE2/ADM细胞P-gp的转运功能增强。

2.5P-gp蛋白表达水平检测结果

Western blot结果显示，在CNE2/ADM和 CNE2细胞中均可见P-gp表达，但CNE2/ADM细胞中P-gp的表达水平明显高于亲本细胞(图4)。

图3CNE2和CNE2/ADM的细胞周期分布

注：A: CNE2; B: CNE2/ADM

图4CNE2和CNE2/ADM中P-gp表达情况

3讨论

MDR 是指肿瘤细胞一旦对一种化疗药物产生耐药性,对其他多种结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药，致使药物疗效逐渐下降的现象[7]，其本质上是肿瘤细胞在生存压力下逐步建立起的一种适应过程[8-9]。体外建立稳定的多药耐药细胞株是研究MDR产生和逆转的基础和前提。药物浓度梯度递增法是目前构建肿瘤多药耐药细胞株较为常用的的方法，虽然其操作费时、繁琐，但容易把握、成功率较高，且所构建的细胞模型耐药性稳定，在撤药后仍能保持较高的耐药性[10]。多药耐药细胞模型构建后的评价方法一般包括：耐药指数的检测、细胞生物指标的检测及耐药标志物的检测[11]。因此，本研究采用阿霉素浓度梯度递增法诱导建立人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM，并从上述3个方面对其生物学特性进行评价。

药物敏感性检测结果显示，CNE2/ADM不仅对阿霉素产生了耐药，而且对顺铂，长春新碱和5-氟尿嘧啶这3种结构和作用机制不同的鼻咽癌化疗药物也产生了不同程度的交叉耐药性，耐药指数分别为12.98、4.84、5.54和2.03。Snow等[12]的分度标准认为，耐药指数<5属低度耐药，5～15之间属中度耐药，>15属高度耐药。依此标准划分，CNE2/ADM 细胞对阿霉素和长春新碱均为中度耐药，而对顺铂和5-氟尿嘧啶则均为低度耐药。CNE2/ADM在不含阿霉素的培养基中反复传代2个月后，其对阿霉素的耐药指数为11.23，仍基本保持原有的耐药性。以上表明，CNE2/ADM细胞株耐药性稳定，并具有多药耐药的基本特征。另一方面，各项生物指标检测结果显示，CNE2/ADM细胞增殖速度减慢，群体倍增时间明显延长。而目前的研究[13]认为，肿瘤细胞的倍增时间越长，对化疗药物的敏感性越差，这与本实验的药物敏感性检测结果相一致。细胞周期分析表明，CNE2/ADM细胞被阻滞于G0/G1期，说明细胞在建模中经阿霉素诱导获得耐药后处于慢周期甚至静息状态，这可能是耐药细胞增殖速度减慢的重要原因，此种现象在由阿霉素诱导的胰腺癌[14]和乳腺癌[15]多药耐药细胞株中也有发生，值得进一步深入研究。

P-gp过表达被认为是耐药细胞最基本或经典的标志，也是目前已公认的MDR生物学基础[16]。P-gp作为一种由多药耐药基因mdr1编码的能量依赖型药物外排泵，将药物由细胞内泵出到细胞外，介导MDR的产生[17-18]。Rho123外排实验则是检测 P-gp 功能的经典实验方法，广泛用于肿瘤细胞中P-gp 药物泵出功能分析[19]。Rho-123作为一种亲脂性阳离子荧光染料，无细胞毒性，是P-gp的良好底物，其在细胞内累积量的减少代表细胞水平P-gp功能的增强[20-21]。本研究对耐药标志物P-gp的检测结果显示，与CNE2细胞相比，CNE2/ADM细胞内Rho-123的累积量显著减少，提示P-gp转运功能增强， 同时P-gp的表达明显上调，经典的MDR途径参与了CNE2/ADM耐药的产生。

综上，众多生物学特性检测结果证实，笔者成功建立了稳定的人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM，其具有典型的多药耐药表型，可作为进一步研究MDR机制及筛选逆转剂较为理想的细胞模型。

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Establishment and Biological Characterization of Human Nasopharyngeal Carcinoma Multidrug-resistant Cell Line CNE2/ADM

JiTaiyang1,LiuJiao2,WangYanqiu2,ZhangZhonglin2△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a human nasopharyngeal carcinoma (NPC) multidrug-resistance cell line CNE2/ADM and to investigate its biological features. MethodsAdriamycin resistance was induced in human NPC cell line CNE2 by continuous exposure to gradually increasing doses of adriamycin. Drug sensitivity, cell morphology, cell growth curves and the population doubling time, cell cycle distribution, the function and expression level of P-gp were investigated to determine the biological features of CNE2/ADM cell line. Results Compared with CNE2, the CNE2/ADM cell line was with significant heteromorphosis. It showed cross-resistance to four drugs such as adriamycin, the population doubling time was longer(P<0.05) and the cell number of the G0/G1 -phase was increased.Meanwhile, that of the S- phase and G2/M-phase decreased (P<0.05), the function of P-gp was enhanced(P<0.05) and the expression level of P-gp was up-regulated. ConclusionThe MDR cell line CNE2/ADM is established successfully. CNE2/ADM cell line shows the typical multidrug resistance phenotype. It is a good model for exploring the mechanism of MDR and the selection of reversal agents.

【Key words】Nasopharyngeal neoplasm; Multidrug resistance; Adriamycin; Cell line

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.004

*基金项目：四川省科技厅项目(No:2014JY0019)

通信作者：△张仲林，E-mail：zhlzhang2007@163.com

【中图分类号】R739.63

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1554.024.html

·论著·