我国西南地区主要谷物表面污染真菌的分离与分子鉴定*

张小春，田艳萍，陈　昊，阳金甫，蒋芳菲,代　娟△

1.成都医学院(成都　610500);2.成都中医药大学(成都　610075)

我国西南地区主要谷物表面污染真菌的分离与分子鉴定*

张小春1，田艳萍1，陈昊1，阳金甫1，蒋芳菲2,代娟1△

1.成都医学院(成都610500);2.成都中医药大学(成都610075)

【摘要】目的了解我国西南地区2014-2015年产主要谷物污染状况，探索谷物表面污染真菌的快速鉴定方法。方法利用孟加拉红培养基进行谷物表面真菌的分离与纯化。选用扩增真菌18S序列的通用引物ITS1和ITS4，通过PCR扩增和序列分析进行菌种鉴定。结果从157份谷物样品中分离得到277株真菌，利用分子生物学鉴定方法成功鉴定，污染率为42.0%，其中小麦主要侵染真菌为枝孢菌属、链孢霉属和小光腔菌属，玉米、大米主要侵染真菌为链孢霉属、曲霉菌属和青霉菌属。结论我国西南地区谷物样品的污染现象比较普遍，产毒菌株污染较为严重，存在潜在风险。选用的引物通用性较好，可用于谷物表面污染真菌的鉴定。

【关键词】谷物；真菌污染；聚合酶链式反应；分子鉴定

谷物的真菌污染是一个全球性的食品安全问题。联合国粮农组织(FAO)统计，全世界约25%的谷物遭受不同程度的真菌及其毒素污染，我国谷物污染情况更为严重[1]。部分真菌产生的次级代谢产物真菌毒素可能具有致癌、致畸、致突变、中毒性肾损害、肝细胞损害、免疫抑制和生殖紊乱等毒性，给人和动物的健康造成巨大隐患[2-3]。近年来，随着谷物农产品的质量安全受到越来越多关注，有关谷物真菌污染分析的报道越来越多[4-6]。我国西南地区是粮食主产区,季节多变,气候潮湿,极易导致粮食的霉变，但有关我国西南地区主要谷物真菌污染情况的调查资料还很缺乏。由于谷物种类多，基质复杂，因此，对谷物中真菌污染的早期、快速、准确检测是预防和控制谷物真菌污染的关键。基于ITS 序列的真菌分子鉴定方法具有高效、可靠等特点[7-8]，目前已有在农产品、化妆品、中药材、临床标本等污染真菌分析方面的研究报道[9-12]，但尚未见用于谷物表面污染真菌的鉴定。本研究从我国西南地区收集谷物样品，包括小麦、玉米和大米，对表面污染真菌进行分离纯化，采用真菌通用引物ITS1和ITS4，通过PCR扩增与测序的方法,对真菌进行分子生物学鉴定，为了解谷物真菌污染状况，建立谷物真菌污染快速鉴定方法提供科学依据。

1材料与方法

1.1样品来源

根据地理位置、气候条件等情况，选择四川、重庆、云南和贵州为采样点。为保证所采样品的代表性，随机采集各省各市(区) 县食品污染物监测点超市、集贸市场及农家的谷物，共采集2014—2015年产小麦、玉米、大米样品157份(表1)。样品采集后置于无菌拉封袋独立密封，编号并记录，于阴凉干燥处保存。

表1　谷物样品信息

1.2试剂

植物基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖和DNA Marker II购自天根生化科技北京有限公司；孟加拉红培养基购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3仪器

PCR 仪，MyCycler(美国 Bio-rad)；生物安全柜，HFsafe-1200TE(上海力申科学仪器有限公司)；超纯水仪，Rios-5 /Milli-Q Synthesis(美国 Millipore)；灭菌锅，HVE-50(日本 Hirayama)。

1.4方法

1.4.1谷物表面污染真菌的分离与纯化取谷物样品25.0 g，置于225.0 mL无菌生理盐水中，充分震荡混匀。将样品溶液依次稀释至10%、1%、0.1%后，分别取100 μL涂布于孟加拉红培养基，28 ℃培养5～7 d，每个浓度各接种2个重复。观察菌落，待纯化后转移到孟加拉红斜面中保存，用于菌种鉴定。除不加谷物外，其余步骤同样处理，作为阴性对照。污染率=分离出真菌的谷物样品数/总的检测谷物样品数×100%。

1.4.2真菌基因组DNA提取将适量菌落放入研钵中，加入液氮快速研磨。抽提采用植物基因组DNA提取试剂盒，具体参照试剂盒说明书进行，电泳观察，最后将抽提的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4.3PCR 扩增及产物测序选用扩增真菌18 S序列的通用引物ITS1和ITS4[13]，由成都擎科生物工程公司合成。引物序列如下：引物ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，引物ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系：2 ×Taq PCR Master Mix缓冲液25 μL，10 μM引物各2.5 μL，真菌基因组DNA 5 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min； 最后72 ℃延伸10 min；35个循环；4 ℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的条带，并送成都擎科生物工程公司测序。

1.4.4DNA 序列比对及分析将所测得的序列提交美国NCBI的GenBank核酸序列数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性搜索。找出与获得片段同源性最高的真菌菌株的参考序列。

2结果

2.1谷物表面污染真菌分离与纯化

本实验对采集的157份谷物样品进行了真菌分离，结果从10份小麦样品，48份玉米样品，8份大米样品，共计66份样品中分离到277株菌株，部分谷物样品分离到4株或4株以上真菌，污染率达42.0%，表明谷物表面真菌污染情况较为普遍。部分菌株的菌落形态见图1。

2.2PCR扩增产物电泳

采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，基于通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，277株真菌菌株均能扩增出目的条带，不同分离株扩增产物为400～600 bp(图2)。

图1部分污染真菌的菌落形态

图2PCR扩增产物电泳图

注: 1～12: 分离的部分真菌的PCR扩增产物；M: DNA Marker

2.3真菌的分子鉴定

将277株真菌菌株的测序结果进行Blast检索，结果发现，277株真菌与GenBank 中已注册的链孢霉属(Neurosporaspp.)、曲霉菌属(Aspergillusspp.)、青霉菌属(Penicilliumspp.)等菌属匹配度较好，序列一致性在96%以上，其中链孢霉属、曲霉菌属、青霉菌属、枝孢菌属(Cladosporiumspp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsisspp.)、小光腔菌属(LeptosphaerulinaChartarumspp.)、链格孢属(Alternariaspp.)、木霉属(Trichodermaspp.)的分离率分别为25.9%、22.4%、12.3%、8.7%、5.4%、5.4%、4.0%、3.6%。小麦中主要侵染真菌为枝孢菌属、链孢霉属和小光腔菌属。玉米、大米主要侵染真菌为链孢霉属、曲霉菌属和青霉菌属(表2)。

表2　不同样品的污染菌类群

3讨论

与传统的真菌形态学鉴定方法相比，真菌分子鉴定大大提高了鉴定效率。ITS 序列为公认的真菌分子鉴定首选序列，本实验选用引物ITS1和ITS4成功鉴定了谷物表面污染的277株真菌，污染率达42.0%，主要污染菌为链孢霉属、曲霉菌属、青霉菌属等，这一结果与链孢霉属、曲霉菌属、青霉菌属是谷物污染的主要检出菌相符合[14-15]，地区间差异不大。选用的引物通用性较好，PCR扩增和测序成功率为100%，可用于谷物表面污染真菌的鉴定。

本研究首次对西南地区主要谷物的真菌污染情况进行调查，结果与马皎洁等[16]的研究一致，谷物样品的污染比较普遍，其中曲霉菌、青霉菌为主要产毒菌株，污染较为严重，分离率为22.4%、12.3%，谷物的真菌污染存在潜在风险。同时各谷物品种间污染真菌的种类也有所差异，玉米污染情况最为严重。原因可能与谷物的基质、品种、收获季节、当地气候条件、储存方式等因素有关。由于真菌的广泛存在，尤其一些产毒真菌，可产生肝脏毒性、血液毒性、免疫毒性和遗传毒性，并进一步诱发肿瘤等疾病，严重威胁人类健康。因此，加强谷物污染真菌的监测,有利于对储藏粮食的科学管理,减少或避免粮食霉变造成的损失，为谷物的食用安全提供保障。如何更好地预防谷物在生产、加工、储藏过程中真菌污染及毒素的形成，仍需进一步研究。

参考文献

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Separation and Molecular Identification of Fungal Contamination on Surfaces of Cereal Samples Collected in the Southwest of China

ZhangXiaochun1,TianYanping1,ChenHao1,YangJinfu1,JiangFangfei2,DaiJuan1△.

1.ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China；2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the fungal contamination of cereal samples collected in the Southwest of China from 2014 to 2015 and explore a rapid method for identifying the fungi of contaminating the cereal surfaces.MethodsThe Rose Bengal Medium was used to isolate and purify the fungi on the surfaces of cereal samples. The primers including ITS1 and ITS4 were employed to amplify the fungal sequences of 18S and the polymerase chain reaction (PCR) and the sequence analysis was adopted to identify the strains. Results277 fungal strains were obtained from the surfaces of 157 cereal samples and identified with the identification method of molecular biology, which showed that the contamination rate of the samples was 42.0%.The major contamination fungi of wheats were cladosporium spp., neurospora spp. and leptosphaerulina chartarum spp., and those of corns and grains were neurospora spp., aspergillus spp. and penicillium spp. ConclusionThe cereals are contaminated universally in the southwest of China. The contamination of toxicogenic strains is more serious, which brings about potential risks. The selected primers have strong universality and can be used to identify the fungi of contaminating the cereal surfaces.

【Key words】Cereals; Fungal contamination; Polymerase chain reaction (PCR) ; Molecular identification

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.012

*基金项目：四川省教育厅一般项目(No：15ZB0247)；四川省大学生创新创业计划项目(No：201513705057)

通信作者：△代娟，E-mail：daijuan_2004_2007@126.com

【中图分类号】R155.5

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160418.1124.012.html

·论著·