庆大霉素导致耳毒性中毒的自噬现象

刘丁丁刘永泽麻晓峰陆玲周函钱晓云高下南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻咽喉头颈外科（南京210008）



庆大霉素导致耳毒性中毒的自噬现象

刘丁丁刘永泽麻晓峰陆玲周函钱晓云高下
南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻咽喉头颈外科（南京210008）

【摘要】目的庆大霉素是一种临床上常用的氨基糖苷类抗生素，随着其使用剂量和作用时间的增加，它的耳毒性逐渐明显。本实验在体外用新生C57BL/6J小鼠的耳蜗基底膜构建庆大霉素耳毒性模型观察自噬的发生。方法体外原代培养的耳蜗基底膜应用庆大霉素之后，行透射电镜观察自噬体的结构，免疫荧光、免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-II的变化。结果在庆大霉素的耳毒性模型中，观察到了自噬现象的发生。结论自噬参与了庆大霉素的耳毒性过程，提示我们干预自噬可以影响庆大霉素的耳毒性过程。

【关键词】毛细胞；庆大霉素；耳毒性；自噬

刘丁丁和刘永泽并列第一作者

This work was supported by the Nanjing Science and technology development Foundation（201303003）and Nanjing Medical Science and technique Development Foundation（QRX11079）of China.

Conflict of interests:The authors declare no conflict of interests.

全世界流行最广的感觉器官残疾是听力损失。依据2014年世界卫生组织报告：全世界有3.6亿人有残疾性听力损失，占全球人口的5％，其中80％残疾人群生活在中低收入国家。听力残疾居于我国残疾人口数量的第二位，近年来随着耳毒性药物使用增加，听力损失的人群数量急剧增长。听力损失最影响与他人沟通的能力，会导致一系列问题。显而易见，听力损失已成为影响社会政治和经济的全球性的健康问题。目前认为哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元不能自发再生，一旦受到损伤将会导致永久性耳聋。

对于肺结核的治疗以及由需氧革兰阴性菌产生的其他疾病，氨基糖苷类抗生素有强大的功效（Fujimoto，Mizuno et al.）。然而，随着氨基糖苷类抗生素使用疗程的延长和（或）剂量的增加往往导致严重肾毒性和耳毒性的发生，其中耳毒性往往是不可逆转的，特别是对于那些遗传易感性的患者［6-7］。由于其价格低廉、低耐药、低过敏，目前仍然在许多发展中国家使用。庆大霉素是一种常用的氨基糖苷类抗生素，因其耳毒性备受关注，被吸收后在内耳淋巴液内蓄积［8-10］。内耳中的毛细胞对其有高度亲和力，吸收后会导致毛细胞的死亡。研究已证明在庆大霉素的耳中毒过程中毛细胞的死亡属于凋亡［11］，凋亡与自噬联系密切［12］，而自噬是否参与毛细胞的死亡过程尚未可知。

上个世纪60年代即在哺乳动物细胞中发现细胞自噬现象［13］，但是涉及到自噬的的细胞成分及机制则是在酵母中得到了验证［14］。现在哺乳动物的同源基因也被发现并在哺乳动物细胞自噬中发挥了重要作用［15-16］。诸如：LC3，Atg8的哺乳动物同源体，通过与脑磷脂结合形成LC3-II，而其位于自噬体膜上，它的表达水平反映自噬水平的高低［17］。自噬是通过一系列复杂的过程，将一个组件或外来入侵者自我消化的过程；是维持细胞稳态和抵抗逆境的重要机制；是亚细胞膜构造产生动态变化并经溶酶体介导对细胞内蛋白质和细胞器降解的过程［14-15，18］。自噬的形成分为四个过程，即自噬前体的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体相结合、消融的一个过程［19］。自噬作为一种细胞对外界刺激的反应［14-15］。尽管近年来自噬研究飞速发展，但在庆大霉素的耳毒性过程中研究甚少。

体外培养的耳蜗中加入庆大霉素可以导致耳蜗毛细胞的损伤，自噬现象是否出现在该种模型中，到目前为止仍然无相关报道。我们本次的研究利用庆大霉素的耳毒性模型证明了该造模过程中自噬的发生。

1　材料和方法

1.1实验材料

出生四天的C57BL/6J的小鼠由南京大学模式动物研究所提供。Millicell购自Millipore公司（PIHT30R48），层粘连蛋白购自BD公司，多聚鸟氨酸、phalloidin均购自Sigma公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚购自碧云天，DMEM购自生兴。兔抗LC3抗体（Sigma Aldrich L7543），Western blot中使用的蛋白裂解缓冲液（RIPA裂解液）购于南通碧云天生物有限公，GAPDH等抗体购于美国Cell Signaling公司；二抗anti-rabbit IgG购于美国Jackson公司。

1.2实验方法

1.2.1耳蜗取材及培养

组织包被液的制作参照之前文献［20］。P4小鼠冰上麻醉后，用75％酒精喷洒C57小鼠头颈部后再移入超净台内断头暴露颅底，在显微镜下用细镊在内耳道处分离暴露整个耳蜗底回并取出耳蜗，在平衡培养液中用镊子打开整个耳蜗，充分暴露膜迷路，去除骨性蜗轴、螺旋韧带、血管纹和盖膜等其他结构，分离出全耳蜗基底膜Corti'S器进行体外培养。吸弃预孵滤膜的混合液，加入适量培养液，用1ml的加样枪把耳蜗转移至滤膜表面，区分正反，在滤膜表面铺放平整，再次吸弃培液，使组织贴壁牢固，之后缓慢加入培养液，以覆盖滤膜和基底膜为宜。在37℃和5％CO2培养箱培养24h以使基底膜贴壁牢固。24h之后更换组织培养液，耳蜗组织被随机分为两组，空白对照组即正常培养液组，庆大霉素组即培养液中加入了100µm/L的庆大霉素。分为两组后再继续培养24h后收样进行后续实验。

1.2.2免疫荧光

药物作用24h之后带有样本的滤膜经4％福尔马林磷酸盐缓冲液在4℃固定2h，用0.1mol/L的PBST漂洗，之后0.1％Triton破膜20分钟，5％BSA封闭30分钟，放入用0.1mol/L PBST（含5％的BSA）稀释（1:200）的LC3抗体，于4℃冰箱孵育过夜。第二天，0.1mol/L的PBST漂洗后加入用0.1mol/L PBST稀释（1:500）的相应的二抗及DAPI（1:2500）和phalloidin（1:500），室温避光2h，漂洗后将带有样本的滤膜用抗荧光淬灭封片剂进行封片。激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.3透射电镜观察

培养48h之后带有样本的滤膜经2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液在4℃固定过夜（前固定），1％四氧化锇于4℃固定2小时（后固定），用1×PBS漂洗3次后梯度脱水：30％丙酮、50％丙酮、70％丙酮、80％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各脱水一次，之后浸透、固化，样品在Reichert超薄切片机中切片，获得50-60nm的切片。柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色15min。Hitachi-7650透射电镜观察，拍片。

1.2.4耳蜗组织的Western blot

耳蜗组织被随机分为两组，对照组即正常培养液组，庆大霉素组即培养液中加入了100µm/L的庆大霉素，两组耳蜗经不同处理后在相同的时间点收取样本。每组取20个耳蜗，在0.1mol/L的PBS中荡洗除去培养液，收集在无酶1.5mlEP管中加入100μL的Lysis Buffer并补充1％的蛋白酶抑制剂PMSF。提取用蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，按比例加入Loading Buffer后沸水浴10min，保存在-70℃。配置15％的分离胶及5％的浓缩胶，之后电泳、转膜及显影。

2　结果

2.1免疫荧光及细胞计数

耳蜗经过不同处理培养之后，毛细胞数量会发生变化，毛细胞数量也间接反映了耳毒性的大小。用FITC-phalloidin标记的毛细胞纤毛（绿色）染色和DAPI（蓝色）染核及自噬标记抗体LC3（红色）的免疫荧光实验（图1A）。空白对照组内外毛细胞没有明显的损失。庆大霉素组毛细胞破坏严重，排列紊乱。同时，我们每组取6个耳蜗根据FITC-phalloidin标记的毛细胞纤毛对毛细胞数量进行了统计，结果如下（图1B）。

图1　利用免疫荧光和毛细胞定量分析系统对耳蜗毛细胞的统计，A:FITC-phalloidin和DAPI及LC3对耳蜗组织的染色结果。Apical:顶转Middle：中转Basal：底转。B:根据FITC-phalloidin染色结果应用毛细胞定量分析软件对细胞数目所做的计数图。每组的耳蜗数均为6个，毛细胞计数即为6个耳蜗分别计数输入软件得到的平均值。bar=10μm。Fig.1 Immunofluorescence and quantitative analysis of hair cells in differet treated groups.（A）Explant culture treated with GM and control（no drug）stained with FITC-phalloidin，DAPI and anti-LC3 labeled protein showed the difference in loss of hair cells in apical，middle and basal region，respectively.（B）Average cytocochleograms represents the percentage of inner hair cell（IHC）and outer hair cell（OHC）loss as a function of percent total distance from the apex of the cochlea.6 specimens were assessed for each condition.

2.2透射电镜观察庆大霉素作用后的自噬体结构

透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，能够放大倍数为几万～几十万倍，是材料研究中的重要技术手段，能观察到细胞内细微结构。取材基底膜制成超薄切片，利用透射电镜观察毛细胞的超微结构。电镜结果显示应用庆大霉素后耳蜗组织出现大量的自噬体。

图2　透射电镜观察对照组及庆大霉素组自噬体结构，对照组没有观察到明显的自噬体结构，细胞核和表面的纤毛结构清晰、完整。庆大霉素组组毛细胞破坏严重，观察到大量的自噬体结构，图中方框中箭头指向自噬体。bar=2μm。Fig.2 Autophagy structure within the hair cells observed under transmission electron microscope.Cochlea in each group showed under TEM for autophagy.Structure of cell membrane looks intact，stereocillia arranged in order，and the organelles seemed normal in control group.After GM treatment，the large amount of autophagosomes（red marked）appeared inside the sensory epithelium and cell membrane becomes ruptured，In the box，the arrow points to the autophagosome.bar=2μm.

2.3Western blot检测LC3蛋白的表达

通过Western blot（图3）分析LC3蛋白的表达。每组收集20个耳蜗作为一组检测了对照组和庆大霉素组LC3蛋白的表达量，发现庆大霉素组LC3的蛋白量表达明显增加。Western blot检测LC3有两条带，LC3-I和LC3-II，而LC3-II结合在自噬体膜上，反映自噬水平。

图3　每组收集20个耳蜗作为一组，用组织蛋白裂解液提取耳蜗蛋白进行Western blot检测LC3的表达，GAPDH作为内参，庆大霉素组的LC3-II的表达量明显增加。Fig.3 The expression of LC3 protein.Western blotting analysis displayed LC3-II formation after GM treatment.Cochleae were incubated with GM for 24h to collect whole cell lysates for immunoblot analysis of LC3.GAPDH was used as a protein loading control.20 specimens were assessed for Western blotting.Abbreviations:

3　讨论

对于庆大霉素损害的听觉机理研究已有很多，研究结果主要涉及毛细胞纤毛和外毛细胞本身的损害从而导致听力的下降［21］。庆大霉素是一种广泛使用的氨基糖苷类抗生素，因其耳毒性而备受关注，氨基糖苷类药物摄取后在内耳淋巴液内蓄积累加，与耳蜗毛细胞亲和力较强，引起的耳蜗毛细胞损害总是从耳蜗底回的外毛细胞开始逐渐向顶回发展，外毛细胞损坏也总是早于内毛细胞。毛细胞死亡有坏死和凋亡两种方式。细胞坏死是某种机械原因或者代谢原因促使细胞内发生一系列降解反应，是细胞的一种被动破坏过程。凋亡也称为“程序性细胞死亡”，是由基因介导的一系列变化，细胞依靠它来主动的引起自身的破坏。有研究证明，由氨基糖苷类抗生素的代表——庆大霉素引起的急性耳中毒过程中，毛细胞死亡100％属于“自杀”，即属于细胞凋亡［11］。

阻止庆大霉素的耳毒性的一个重要目标是保护毛细胞，众所周知，凋亡是毛细胞的主要死亡方式［11］。因此，许多药物被用来评估由庆大霉素导致的耳毒性中毛细胞的保护作用并且证实能够减轻凋亡［22-24］，这些化合物包括铁鳌合剂［25］和抗氧化剂［26］。而凋亡与自噬的关系又非常密切［12］。到目前为止，对于氨基糖苷类抗生素引起的耳聋的发病机制仍然不是十分清楚，也无有效治疗方法。鉴于此，本研究考虑建立该疾病的离体模型，并通过该模型证明自噬在耳毒性过程中的发生。近期Jing Cui等在猪中报道了自噬激活剂雷帕霉素通过增强自噬可以改善庆大霉素导致的肾脏毒性［27］。而庆大霉素的耳毒性与自噬的关系目前无任何文献报道，因此这是今后研究的重点。

自噬与凋亡之间的关系虽有争议，但一般都是受一些共同调节因素的影响，两者之间存在相互作用，以及对细胞的生存起着重要的作用。目前自噬和凋亡的关系大致有以下三种关系［28］：自噬和凋亡都可引发细胞的死亡（图a），这类观点包括：自噬和凋亡无相互的作用，各自引发细胞的死亡；自噬处在凋亡的上游，在诱发凋亡的同时也引发细胞的死亡；凋亡也可抑制自噬发生，当抑制凋亡时，才能诱发自噬导致细胞死亡。自噬还可以抑制凋亡通路：自噬通过降解受损蛋白、降低DNA的损伤途径减少细胞凋亡（图b）。自噬促进细胞凋亡：细胞自噬本身不引起细胞的死亡，但它能够为凋亡小体形成提供能量，促进细胞凋亡发生（图c）。自噬和凋亡的关系可以用下图概括说明（引自文献28）。

自噬研究已有几十年，超过30个自噬相关基因已被发现，自噬研究也越来越透彻。有趣的是，自噬可以导致细胞存活也可以导致细胞死亡，尽管很大程度上不知道什么决定了它的最终结果［29-30］。虽然自噬研究飞速发展，但很少研究耳蜗组织中的自噬以及它的调控和病理生理作用。

本实验主要是在体外培养的耳蜗组织中进行，在培养过程中加入庆大霉素可以导致毛细胞损伤死亡，这种模型已被诸多实验所证明。研究运用多种技术证明在这种模型中自噬的发生，包括透射电镜技术分析自噬体结构、免疫荧光及免疫印迹技术分析自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的表达。对比这些组织培养技术，体内实验自噬相关标记的检测由于耳蜗的特殊性而被限制。在体外培养的耳蜗中，证明了加入庆大霉素之后能够破坏毛细胞并且透射电镜及免疫印迹均证明了自噬的存在。

结合研究的结果，推测自噬很有可能参与了氨基糖苷类抗生素的耳毒性过程。提示研究者干预自噬有可能成为治疗耳聋新的靶点。这将是关于毛细胞凋亡机制一个新的发现。因此，后续重点研究自噬的分子机制及信号通路，将能更好地了解如何操纵这一信号通路满足治疗目的。这仍是一个年轻的研究领域，还有许多未知事物，这项工作才刚刚开始，最后，用药物调控这些信号通路有可能为对抗疾病指出了一些可能的治疗策略。本研究的完成，将证明自噬在氨基糖苷类抗生素耳毒性过程中的发生，将为认识氨基糖苷类抗生素的耳毒性打开新的篇章，同时为临床上相应的治疗提供新的思路。

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The Phenomenon of Autophagy in Gentamicin Induced Ototoxicity

LIU Dingding，LIU Yongze，MA Xiaofeng，LU Ling，ZHOU Han，QIAN Xiaoyun，GAO Xia
Department of Otolaryngology，Drum Tower Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing，210008
Corresponding author:GAO Xia，E-mail:xiagaogao@hotmail.com

【Abstract】Objective Gentamicin is a frequently used aminoglycoside antibiotic.With increasing dose and duration，its ototoxicity side effects will gradually appear.The current study aims to study the phenomenon of autophagy in gentamicin induced ototoxicity.Methods The cochlea was cultured with gentamicin exposure.Transmission electron microscopy，immunofluorescence and Western blotting were used to observe the expression of autophagy protein LC3 in the explant culture treated with the gentamicin.Results In vitro administration of gentamicin in mouse cochlear cultures induced the formation of autophagic vesicles and autophagosomes in hair cells.Conclusion Our results demonstrate that autophagy participates in the process of ototoxicity induced by gentamicin and suggest that intervention aimed at autophagy may influence the ototoxicity process.

【Key words】Hair cells；Gentamicin；Ototoxicity；Autophagy

【中图分类号】R764

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）02-260-5

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.027

基金项目：南京市科技计划项目（编号：201303003）南京市医学科技发展资金资助（编号：QRX11079）

作者简介：刘丁丁，硕士在读，研究方向:耳内科基础

通讯作者：高下，Email:xiagaogao@hotmail.com

收稿日期：（2015-11-04审核人：郭维维）