乳酸菌添加剂对青贮饲料中微生物菌群的影响

李宝明,杨织瑞

(甘肃畜牧工程职业技术学院,甘肃 武威733006)

乳酸菌添加剂对青贮饲料中微生物菌群的影响

李宝明,杨织瑞

(甘肃畜牧工程职业技术学院,甘肃 武威733006)

摘要：为研究乳酸菌添加剂对青贮饲料中微生物菌群的影响，通过添加CaCO3、纤维素酶、淀粉酶、尿素进行玉米秸秆青贮饲料的发酵试验。结果表明，添加CaCO3 0.5%、纤维素酶0.01%、淀粉酶0.01%时青贮过程中乳酸菌生长速度显著高于其他试验组，细菌、酵母菌、霉菌显著低于其他试验组；有氧暴露后，乳酸菌数量降低速度显著低于其他试验组，细菌、酵母菌、霉菌生长速度显著低于其他试验组。

关键词：青贮饲料；微生物菌群；乳酸菌添加剂

玉米青贮过程是一个复杂的微生物体系，包括乳酸菌、腐败菌、酵母菌、霉菌、芽胞杆菌等多种微生物，其中乳酸菌被认为是青贮发酵成功的关键微生物。在青贮过程中随着厌氧和低pH环境的形成，酵母菌、霉菌、腐败细菌在青贮饲料的发酵过程中逐渐减少。但是一旦青贮发酵池开启，青贮饲料和空气接触，上述腐败微生物迅速生长和乳酸菌争夺营养物质，酵母菌还会分解乳酸使青贮饲料pH增大，进一步为腐败微生物的生长创造适宜的条件，从而导致青贮饲料腐败变质。本试验以优良乳酸菌、纤维素酶、淀粉酶、CaCO3和尿素作为添加剂，通过跟踪青贮过程、有氧暴露后的微生物动态变化，以及各阶段青贮饲料的pH变化从而筛选出更加适合青贮发酵的优良乳酸菌接种剂。

1材料与方法

1.1材料1.1.1 菌种经过前期试验筛选并结合菌种自身特性和菌种多样性选取以下菌株用于青贮试验。肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceu)B2-3、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3-1eEnterococcus faecium)B5-2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)E2-3等菌种均为前期试验分离菌株，由本实验室分离鉴定并保存。1.1.2培养基MRS：蛋白胨 10 g、牛肉膏 10 g、酵母膏 5 g、K2HPO42 g、葡萄糖 20 g、 乙酸钠 5 g、吐温-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸馏水 1 000 mL。

琼脂培养基：牛肉膏 1 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g。

1.1.3仪器与材料723N可见分光光度计(上海科恒事业发展有限公司)、DZ-300A多功能真空封口机(温州卓越机电有限公司)、酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；22 cm×28 cm聚乙烯包装袋(东旭化工塑料有限公司)、孟加拉红培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司、麦芽浸膏琼脂培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.1.4青贮样品及处理青贮用全株玉米采自甘肃省临洮县华加畜牧有限公司，将试验用全株玉米经切割机切成2～4 cm后备用。

1.2方法

1.2.1试验分组设计试验乳酸菌为肠系膜明串珠菌肠膜亚种B1-7，戊糖片球菌B2-3，植物乳杆菌B3-1，屎肠球菌B5-2，发酵乳杆菌E2-3混合菌群。试验所用乳酸菌的菌种含量为1×109CFU/mL，接种量为5 mL/kg，即5×106CFU/g。如表1添加不同水平的纤维素酶、淀粉酶、CaCO3和尿素作为添加剂，进行青贮。

1.2.2青贮饲料的制作将新鲜玉米秸秆切至2～4 cm左右，用微波炉进行快速干燥，以掌握含水量，当含水量达到70%左右进行青贮。乳酸菌菌液培养物按设计量用灭菌喷壶均匀喷洒于切碎的玉米秸秆上，其他成分按照表1准确称量与玉米秸秆均匀混合。按500 g/袋装入聚乙烯青贮袋中，按紧、压实，利用真空封口机抽气封口，每个处理30个重复。于恒温环境(20 ℃)中进行发酵，整个试验青贮期为30 d，有氧暴露期为15 d。分别在青贮后第0、3、15、30 d，青贮结束后开启剩余青贮袋有氧暴露，在开袋后第1、7、15 d取样，每处理同时取3袋，进行相关指标的测定。

表1　试验分组设计

注：对照组添加5mL培养液

1.2.3微生物计数及结果统计准确称取25 g样品，加入225 mL的无菌生理盐水，37 ℃恒温摇床摇动2 h后做10倍梯度稀释后备用。乳酸菌的计数用MRS培养基，将接种好的培养皿密封好后置于37 ℃培养3 d后统计菌落数；细菌计数采用普通琼脂培养基，接种好以后置于37 ℃培养24 h后统计菌落数；酵母计数采用孟加拉红培养基、真菌计数采用葡萄糖麦芽浸膏培养基，接种好以后置于25 ℃培养3 d后统计菌落数，每组设3个重复。

1.2.4青贮饲料pH测定采用四分法称取25 g样品，加入225 mL的无菌生理盐水，4 ℃侵泡12 h后测定样品pH。

1.2.5统计分析用SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1乳酸菌数量的变化

由表2可见，在青贮初期各试验组和对照组乳酸菌数量快速增加，其中试验组1、2、4、5、6、7、8乳酸菌生长较快均在4×107CFU/g以上。各组乳酸菌数量在第15 d时达到最大，试验组1、2、6乳酸菌数量达到1×108数量级以上，其他试验组以及对照组乳酸菌数量达到1×107数量级以上，各试验组与对照组之间差异显著。此后乳酸菌数量逐步减少，各试验组乳酸数量均显著大于对照组，其中试验组1、6显著大于其它试验组。

有氧暴露期间各试验组和对照组的乳酸菌数量继续减少，有氧暴露第15 d时试验组乳酸菌数量下降为1×105数量级、对照组为1×104数量级。各试验组均显著高于对照组，其中试验组1和试验组6的乳酸菌数量均高于其它试验组。

表2　青贮饲料中乳酸菌数量的动态变化

注： 0 d表示青贮前，1～30 d表示青贮期，31～45 d表示暴露期。

2.2细菌数量的变化

由表3可见，青贮初期各处理组和对照组的细菌数量均不同程度增加，第3 d时基本达到最大值，以后细菌数量逐渐减少，青贮第30 d时试验组5、6的细菌数量均显著低于其它试验组和对照组。

青贮开启后各试验组细菌数量均有所增加。开启第7 d时细菌数量达到最大，第15 d细菌数相对有所减少但趋于平缓，各组细菌数量均在1×107CFU/g。

表3　青贮饲料中细菌数量的动态变化

2.3酵母菌数量的变化

由表4可见，青贮期各试验组和对照组的酵母菌数量在第3 d达到最大，以后逐渐减少。第30 d时除试验组7其余各组酵母菌数量均小于1×102CFU/g。

随着暴露期延长酵母数量逐渐增多，第15 d时各组酵母菌数量均大于1×106CFU/g，各试验组酵母菌数量均显著低于对照组，其中试验组5、6酵母菌数量显著低于其它试验组。

表4　青贮饲料中酵母菌数量的动态变化

2.4霉菌数量的变化

由表5可见，青贮期各试验组和对照组的霉菌数量差异不明显，随着青贮发酵的进行霉菌逐渐减少，在第15 d时各组霉菌数量均小于1×103CFU/g。

青贮开启15 d后各组的霉菌数量上升较大，第15 d时试验组1和试验组6霉菌数量达到1×104CFU/g数量级，其余试验组以及对照组霉菌数量达到1×105CFU/g。试验组1和试验组6的霉菌数量显著低于其它试验组。

2.5pH的变化

随着青贮的进行各试验组和对照组的pH均下降。第15 d试验组1、6及对照组pH降至4.2以下。第30 d试验组1、2、6、7及对照组pH降至4.2以下。有氧暴露后第1 d，试验组1、4、6及对照组pH继续小幅降低，其余试验组pH有小幅上升。第15 d，试验组1、6及对照组pH值基本维持在4.2以下，其余试验组pH都大于4.2。

表5　青贮饲料中霉菌数量的动态变化

表6　青贮饲料pH值动态变化

3讨论

3.1玉米青贮过程中乳酸菌数量的变化

玉米青贮饲料中的乳酸菌是起主要作用的益生菌，它在厌氧状态下将原料中的碳水化合转化为乳酸。本试验中乳酸菌数量在青贮初期迅速增长，在第 15 d时达到顶峰，之后有缓慢下降，最后维持在107数量级。在青贮发酵过程和有氧暴露后，各处理组乳酸数量均显著大于对照组，其中试验组1、6显著大于其它试验组，证明青贮时添加优良乳酸菌和酶制剂都有利于青贮体系中乳酸菌快速繁殖。青贮装袋时要求快速而且要压实，空气排出的程度对青贮质量影响很大，压实良好的青贮料 30 min内可使环境中含氧量低于 0.5%(Woolofdr，1990)。青贮过程要求的环境氧最高不能超过 1%(体积比)，高于这个数值厌氧环境就会被破坏(Liske 等，1989)，但这种环境仍可足以维持一些需氧微生物的生长，如果青贮料处理不善这个问题会变得更为严重。实际上，随着青贮饲料发酵过程的进行，乳酸菌对其他微生物的拮抗作用也有增加(Taylor, 2002)。

3.2玉米青贮过程中细菌数量的变化

本试验中在青贮的第3 d细菌数较青贮前有大幅增长，这主要是由于在青贮早期环境中残留部分氧气从而使细菌快速生长，一般情况下如果青贮制作良好，腐败菌会因缺氧逐渐停止活动甚至死亡，部分厌氧的芽胞菌继续存在。青贮饲料开窖后随着青贮酸性环境的丧失以及有氧环境的形成，腐败菌的活动慢慢增强。青贮第30 d时试验组5、6的细菌数量均显著低于其它试验组和对照组。本试验中腐败菌在青贮开启前7 d快速增加，之后腐败菌缓慢减少可能是由于青贮饲料中营养物质被消耗完导致细菌数量减少。这说明，添加乳酸菌和酶制剂可有效抑制有害细菌的繁殖，但添加CaCO3和尿素不利于有害细菌数量的控制，可能是因为CaCO3和尿素这类弱碱性物质影响的乳酸的累积。

3.3玉米青贮过程中酵母菌和霉菌数量的变化

青贮饲料正常发酵时，随着氧气的耗尽酵母菌和霉菌数量减少。适量的酵母可以使青贮饲料产生酒香味，从而提高饲料的适口性。但当青贮饲料开窖后酵母菌和霉菌的活动加强并且分解乳酸使青贮饲料发生二次发酵导致饲料腐败变质。在青贮初期酵母菌和霉菌快速生长，主要是由于青贮制作中残留空气造成的，本试验中青贮发酵初期酵母菌数量显著高于青贮前，随后酵母菌数量较少。青贮后期酵母菌和霉菌快速减少，主要是由于青贮饲料中的氧气随着发酵的进行而耗尽形成厌氧环境，另一方面乳酸菌的快速生长形成低pH环境和乳酸菌的分泌物抑制了酵母菌和霉菌的繁殖。有氧暴露开始后由于和空气接触酵母菌和霉菌的数量逐渐增加，但在整个有氧暴露阶段各试验组的酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组的，并且5和6组的酵母菌数量要少于其他试验组，1和6组的霉菌数量要少于其他试验组，这说明乳酸菌的快速繁殖有抑制酵母菌和霉菌的作用这和文献的描述相一致。

3.4玉米青贮过程中pH的变化

pH是衡量青贮的酸度指标，pH的高低是青贮饲料是否青贮成功的重要指标，pH在4.0以下的青贮饲料，质量优等；pH4.1～4.3，质量良好；pH4.4～5.0，质量一般；pH在5.0以上，质量劣等。本试验中添加了尿素的试验组pH相对较高，试验组1、6 和对照组在第15 d都降到4.0以下，效果较好。产生这种效果的原因可能是由于这3组中都未添加尿素，尿素弱碱性，遇到酸可行成盐，影响了青贮过程中有机酸的累积。Lessard 等用尿素处理玉米青贮，发现在青贮过程中，用尿素处理后青贮饲料含有较多粗蛋白，并且可降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，表明尿素处理玉米秸青贮可以改善玉米秸青贮饲料的营养价值。本试验青贮饲料的营养成分分析正在进行，能否改善全株玉米青贮品质还需后期结果验证。

试验组4在青贮过程中pH下降最慢，在第30 d时还在5.52，属于劣质青贮饲料，究其原因发现，试验组4是唯一没有添加纤维素酶的试验组，可见纤维素酶在青贮过程中，对乳酸菌产生积累有机酸具有重要的意义，可以考虑在以后的试验中，在添加CaCO3和尿素等碱性物质时可增加纤维素酶的添加量，保证青贮顺利进行。

4结论

玉米秸秆青贮过程中添加乳酸菌及纤维素酶、淀粉酶在促进乳酸菌的快速繁殖产酸、抑制有害细菌、酵母和霉菌的活动,添加CaCO3和尿素则具有相反的作用。

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Effect of Lactic Acid Bacteria Additive on the Microbial Groups in Silage

LI Bao-ming, YANG Zhi-rui

(GasuPolytechnicCollegeofAnimalHusbandry&Engineering,WuweiGansu733006)

Abstract:In order to research the effects of lactic acid bacteria additive on microbial colony in silage, the CaCO3, cellulase, amylase and urea were added to study the fermentation test of corn straw silage. The results showed that when the 0.5 % CaCO3, 0.01% cellulase and 0.01% amylase were added to the process of silage, the growth rate of lactic acid bacteria was significantly higher than the other groups, and the growth rates of bacteria, yeast and mold were significantly lower than the other groups. When silage was exposed to oxygen gas, the velocity of the number reduction of lactic acid bacteria was significantly lower than other treatment groups, and the growth rates of bacteria, yeast and mold were significantly lower than other treatment groups.

Key words:silage；microbial groups；lactic acid bacteria additive

[收稿日期]2015-09-14

[作者简介]李宝明(1979-)，甘肃环县人，本科，讲师，主要从事动物检疫、兽医卫生检验等课程的理论与实践教学工作。

[中图分类号]S 816.653

[文献标识码]A

[文章编号]1004-6704(2016)01-0013-05