白花蛇舌草及其混淆品中5种抗肿瘤核苷类成分含量测定

王新凤 马传江 曹广尚

摘要：目的 建立超高效液相色谱法（UPLC）同时测定白花蛇舌草及其混淆品中胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷5种抗肿瘤核苷类成分的方法，并比较其含量差异。方法 采用UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，检测波长254 nm，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃。结果 5种核苷类成分线性关系、精密度、稳定性、重复性均符合方法学相关要求，加样回收率为98.7%～101.5%。应用所建方法测定了不同产地白花蛇舌草和其常见混淆品中5种核苷类成分的含量。结论 本研究所建立的方法简单、快速、准确、可靠，适用于白花蛇舌草及其混淆品中核苷类成分的含量测定。

关键词：白花蛇舌草；含量测定；核苷；超高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.023

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0092-03

Content Determination of Five Nucleosides in Hedyotis Diffusa and Its Adulterants by UPLC WANG Xin-feng， MA Chuan-jiang， CAO Guang-shang （The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China）

Abstract： Objective To explore an UPLC method for simultaneous content determination of the five nucleosides （cytidine， uridine， adenine， thymidine and adenosine） in Hedyotis diffusa and its adulterants； To compare the content differences. Methods The analysis was performed on a BEH C18 column （2.1 mm×50 mm， 1.7 ?m） by UPLC eluted with acetonitrile and water in gradient mode. The flow rate was 0.5 mL/min； the detection wavelength was set at 254 nm； the column temperature was set at 30 ℃. Results Five nucleosides have good linear relationship， precision， stability， and repeatability according to the requirements of the methodology determination. The recoveries were among 98.7%–101.5%. Five nucleosides in Hedyotis diffusa and its adulterants from different areas were determined by the UPLC method. Conclusion The method is certified to be simple， rapid， accurate and reliable， which can be used for the determination of nucleosides in Hedyotis diffusa and its adulterants.

Key words： Hedyotis diffusa； content determination； nucleosides； UPLC

白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Wind.）Roxb.的干燥全草，具有清热解毒、活血化瘀、利湿通淋的功效[1]，临床常用于抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、抗炎等[2]。白花蛇舌草临床应用广泛，但多数地区使用的白花蛇舌草实为同科同属植物伞房花耳草Hedyotis corymbosa（L.）Lam.（又名水线草），或两者混合使用。核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，通过激活人体中的嘌呤受体发挥多种生理作用，其质量控制方法也多有报道[3-5]。本课题组前期研究表明其所含核苷具有良好的抗肿瘤活性[6]，但目前尚未见

基金项目：国家自然科学基金（81274052）；山东省自然科学基金（ZR2015HL116、ZR2011HL043）

通讯作者：曹广尚，E-mail：cgs198041@163.com

对本品中核苷类成分进行含量控制的报道。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）对白花蛇舌草及其混淆品中胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷5种活性核苷类成分同时进行测定并比较其含量差异，为临床合理使用白花蛇舌草提供依据。

1 仪器与试药

Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色谱仪（美国Waters公司，光电二极管阵列检测器，自动进样器），AE200s电子分析电平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KQ5200DA超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

尿苷（批号110887-200001）、腺嘌呤（批号110886-200001）、腺苷（批号110879-200202）均购自中国食品药品检定研究院，胞苷（批号101056874）购于 Sigma公司，胸苷（批号T55590BGF0）购于天津希恩思生化科技有限公司。白花蛇舌草（产地分别为江苏、山东、广东、福建、云南、广西、安徽和湖北）、伞房花耳草（产地分别为江苏、河南、广东、福建、云南、江西、广西、安徽）经山东中医药大学附属医院马传江副主任药师鉴定，分别为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Wind.）Roxb.的干燥全草及茜草科植物伞房花耳草Hedyotis corymbosa（L.）Lam.的干燥全草。乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），甲醇（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司），水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～5 min，0%～5%A；5～10 min，5%～10%A；10～20 min，10%A；20～25 min，10%～0%A），流速0.5 mL/min，检测波长254 nm，进样量10 ?L，柱温30 ℃。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷对照品适量，分别用20%甲醇配制成浓度为0.675、0.728、0.693、0.536、0.129 mg/mL的对照品储备液。取上述胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷储备液适量，用20%甲醇配制成浓度分别为 67.50、72.80、69.30、53.60、12.90 ?g/mL混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取白花蛇舌草药材粉末（过40目筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液20 mL，用氨水调pH至10.0，用水饱和正丁醇振摇提取5次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，残渣加20%甲醇定容至1 mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，摇匀，分别取10 ?L 进样，在上述色谱条件下进行分析。以对照品溶液质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 1。

2.5 精密度试验

精密量取混合对照品溶液2.5 mL，置 5 mL 量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，摇匀，在上述色谱条件下，连续进样6次，结果胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷峰面积RSD分别为 1.4%、1.5%、0.9%、1.1%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的RSD分别为2.8%、1.5%、1.8%、2.4%、2.7%，表明供试品溶液各成分在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称定同一样品 6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的 RSD分别为1.9%、1.8%、2.2%、1.9%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取同一批次白花蛇舌草药材6份，各约0.5 g，分别精密加入一定量对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。在上述色谱条件下分析测定，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的平均回收率为99.42%～100.48%，RSD为0.72%～1.09%，见表2。

2.9 样品含量测定

取10个不同产地白花蛇舌草药材及其混淆品伞房花耳草，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分析测定，每批样品测定3份，计算平均值，结果见表3。

3 讨论

现行《中华人民共和国药典》及有关地方标准目前尚未对白花蛇舌草进行指标成分含量控制。本品野生和栽培产量有限而临床需求量大，导致市场上以次充好、以假乱真，严重影响临床疗效。其中以同科同属伞房花耳草为其主要混淆品，加之二者所含部分成分相近，临床上常以之代替或掺杂使用。近年来，随着对白花蛇舌草的关注，对二者的研究较多，但多基于性状鉴别或黄酮、三萜等单一成分比较，相关研究不够深入。本研究建立了5种核苷类成分的含量测定方法，并与其混淆品进行初步比较，结果表明不同产地白花蛇舌草中5种核苷类成分存在差异，可知地域环境等对其成分影响较大，正品与其混淆品中5种成分含量也存在差异，这可能是二者在功效上存在差异的原因之一。

本试验分别对甲醇-水和乙腈-水作为流动相系统进行考察，结果5种核核苷类成分在乙腈-水梯度洗脱系统的分离效果更好，且采用UPLC较HPLC测定快速、结果准确，稳定性好，是一种测定白花蛇舌草中核苷类成分的可靠方法。核苷类成分显弱碱性，极性大，较难分离。供试品溶液制备中将水提取液调至pH值为10.0，核苷类呈分子态，再利用水饱和正丁醇充分萃取，即可将核苷类成分与其他成分分离，达到较好的提取除杂效果。

本方法简便、结果可靠，以此为基础继续开展基于多种类指标成分及指纹图谱的质量控制，可对白花蛇舌草及其混淆品从成分、药效等多角度鉴别。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录23.

[2] 黄建荣，刘咏海，喻志标，等.白花蛇舌草化学成分和药理活性研究进展[J].中成药，2005，27（11）：1329-1331.

[3] YANG F Q， LI D Q， FENG K， et al. Determination of nucleotides， nucleosides and their transformation products in Cordyceps by ion- pairing reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，2010，1217：5501-5510.

[4] 刘睿，马思萌，孙璐，等.HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分[J].中草药，2013，44（18）：2542-2546.

[5] 罗珊珊，陈畅，史艳秋，等.九州虫草中核苷类成分的HPLC法测定[J].中草药，2005，36（10）：60-62.

[6] 张鹏，赵启韬，杨培民，等.白花蛇舌草核苷体外抗肿瘤作用实验研究[J].时珍国医国药，2012，23（8）：1901-1902.

（收稿日期：2015-10-16）

（修回日期：2015-12-25；编辑：陈静）