3种含重金属制剂的微生物限度检查方法的验证

管敏 周琴妹

摘要：目的 建立定痫丸、皮脂搽剂和加味黄芩油膏3种含重金属制剂的微生物限度检查方法。方法 按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）的规定测定3种制剂对细菌、真菌和酵母菌的回收率，并对其控制菌检查方法进行验证。结果 定痫丸采用培养基稀释法、皮脂搽剂采用预滤过和培养基稀释法联用、加味黄芩油膏采用萃取法处理样品，5株菌回收率均可达70%以上，控制菌检查也分别采用相应的方法。结论 本研究建立了定痫丸、皮脂搽剂和加味黄芩油膏3种不同剂型含重金属制剂的微生物限度检查方法。

关键词：培养基稀释法；萃取法；重金属；微生物限度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.026

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0101-03

Verification of Microbial Limit Test Methods for Three Kinds of Preparations with Heavy Metals GUAN Min， ZHOU Qin-mei （Pharmacy Department of Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

Abstract： Objective To establish the methods of microbial limit test for three kinds of preparations with heavy metals， such as Dingxian Pills， Pizhi Lotion and Jiawei Huangqin Ointment. Methods According to Chinese Pharmacopoeia 2010， the recovery rates of bacteria， fungus and yeast treated by three preparations were detected. And the methods of testing control bacteria were also validated. Results Culture medium dilution method was proved to be applicable for Dingxian Pills. Culture medium dilution method combined with pre-filtration method was proper for Pizhi Lotion. And the extraction method was adopted for Jiawei Huangqin Ointment. The recovery rates of these five validation strains reached 70% by appropriate methods. And the same methods were used for validation of the control bacteria. Conclusion The methods of microbial limit test for these three different preparations were established through this study.

Key words： culture medium dilution method； extraction method； heavy metals； microbial limit test

定痫丸、皮脂搽剂和加味黄芩油膏均为本院制剂，临床使用多年。定痫丸为口服丸剂，用于痰迷惊厥、牙关紧闭、抽搐痉挛等癫痫病症。皮脂搽剂和加味黄芩油膏分别为外用酊剂和油膏剂，具有解毒、止痒等功效。该3种制剂为不同剂型，且都含有重金属成分，已知重金属砷、汞等对微生物的生长有抑制作用[1-2]，本研究按照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）[3]的要求，采用合适的样品处理方法，如培养基稀释法、预滤过法、萃取法或几种方法联用，消除3种制剂的抑菌作用后再进行检验，以期获得更可靠、更准确的微生物限度检查方法。

1 仪器与试药

YX-280 D-TT手提式压力蒸汽灭菌器（合肥华泰

基金项目：江苏省中医院科研项目（Y13043）

通讯作者：周琴妹，E-mail：zhoumeizi0917@163.com

医疗设备有限公司），DNP-9082电热恒温培养箱（上海申贤仪器设备厂），MJ-100B霉菌培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），100级洁净工作台（AIR TECH，苏州安泰空气技术有限公司），DKZ系列电热恒温振荡水槽（上海一恒科技有限公司），灭菌移液管（1、5、10 mL）及无菌培养皿（90 mm）。

供试品定痫丸（由朱砂、青果、贝母等组成，批号1501001、1503002、1505003）、皮脂搽剂（由硫磺、白矾、轻粉组成，批号1505005、1505006、1507007）和加味黄芩油膏（由轻粉、石膏、冰片、枯矾、黄芩等组成，批号1412005、1503001、1507003）均由本院制剂部生产。

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]，均由江苏省药检所提供，传代次数均为第4代。

营养琼脂培养基（批号131224）、营养肉汤培养基（批号070313）、改良马丁培养基（批号1110203）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号1401132）、胆盐乳糖培养基（批号1401072）、改良马丁琼脂培养基（批号050407）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG，批号101020）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号100128）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号150513），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号1306192），均购自北京三药科技开发公司。0.9%无菌氯化钠溶液（本实验室配制）。

2 方法

2.1 供试液的制备

2.1.1 定痫丸 称取本品10 g，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100 mL，振荡箱中45 ℃振摇30 min，倒入研钵中研磨均匀，作为1∶10供试液。

2.1.2 皮脂搽剂 本品振摇均匀，量取10 mL，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100 mL，振摇均匀，作为1∶10供试液，采用脱脂棉对供试液进行预过滤[3]，去除沉淀，滤液备用。

2.1.3 加味黄芩油膏 称取样品10 g于无菌研钵中，加入无菌十四烷酸异丙酯20 mL，研磨均匀，转移至分液漏斗中，加入45 ℃、pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇5 min，静置，使油水分层，取水层，作为1∶10的供试液[4]。

2.2 菌液制备

大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，于35 ℃培养24 h；白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，于28 ℃培养24 h。上述培养物用0.9%无菌氯化溶液10倍稀释至相应浓度，制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。黑曲霉新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基中，培养5 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液5 mL，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数

2.3.1 菌落培养及计数 ①常规方法：取供试液1 mL及试验用菌的各种菌液1 mL，立即倾注15～20 mL温度不超过45 ℃营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，于相应温度条件下倒置培养，计数。②培养基稀释法：取供试液1 mL平均加至多个平皿中，加入试验用菌的各种菌液1 mL，培养并计数。试验组加供试液及各试验菌液，菌液组不加供试液，供试品对照组不加菌液，稀释剂对照组用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，其余操作方法相同。

2.3.2 回收率计算 以上试验重复3次，分别计算5种试验菌株的回收率。稀释剂对照组回收率（%）=稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数×100%。试验组回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%。

2.4 控制菌检查

2.4.1 大肠埃希菌 ①试验组：取定痫丸1∶10供试液10 mL及1 mL大肠埃希菌（含菌数为10～100 cfu），加入200 mL胆盐乳糖培养基中，经35～37 ℃培养24 h后，再进行MUG试验和靛基质试验。②空白对照组：取1∶10供试液10 mL，加入200 mL胆盐乳糖培养基中，经35～37 ℃培养24 h后，再进行MUG试验和靛基质试验。③阴性组：1 mL金黄色葡萄球菌（含菌数为10～100 cfu），加入200 mL胆盐乳糖培养基中，经35～37 ℃培养48 h后，再进行MUG试验和靛基质试验。

2.4.2 金黄色葡萄球菌 ①试验组：取皮脂搽剂和加味黄芩油膏供试液各10 mL及1 mL金黄色葡萄球菌（含菌数为10～100 cfu），加入适量营养肉汤培养基中，经35～37 ℃培养24 h后，再用甘露醇氯化钠琼脂平板分离培养24 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。②空白对照组：取皮脂搽剂和加味黄芩油膏供试液各10 mL，加入适量营养肉汤培养基中，经35～37 ℃培养24 h后，再用甘露醇氯化钠琼脂平板分离培养24 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。③阴性组：1 mL大肠埃希菌（含菌数为10～100 cfu），加入适量营养肉汤培养基中，经35～37 ℃培养24 h，再用甘露醇氯化钠琼脂平板分离培养24 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。

2.4.3 铜绿假单胞菌 ①试验组：取皮脂搽剂和加味黄芩油膏供试液各10 mL及1 mL铜绿假单胞菌液（含菌数为10～100 cfu），加入适量胆盐乳糖培养基中，振摇均匀，经35～37 ℃培养24 h后，再用溴化十六烷基三甲铵琼脂平板分离培养48 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。②空白对照组：取皮脂搽剂和加味黄芩油膏供试液各10 mL，加入适量胆盐乳糖培养基中，振摇均匀，经35～37 ℃培养24 h后，再用溴化十六烷基三甲铵琼脂平板分离培养48 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。③阴性组：1 mL金黄色葡萄球菌（含菌数为10～100 cfu），加入适量营养肉汤培养基中，经35～37 ℃培养24 h，再用溴化十六烷基三甲铵琼脂平板分离培养48 h，观察有无菌落及菌落形态，判断结果。

3 结果

3.1 细菌、霉菌及酵母菌计数验证

定痫丸、皮脂搽剂和加味黄芩油膏采用常规方法验证的回收率不满足要求。①定痫丸采用培养基稀释法验证（0.5 mL/皿），其抑菌作用基本被消除，5种菌回收率均>70%，可采用培养基稀释法检查细菌、真菌及酵母菌计数。②皮脂搽剂的溶剂为60%乙醇，其中有白矾、轻粉为不溶性沉淀，配成1∶10供试液之后，硫磺不溶于水也析出，前期试验发现这些沉淀具有较强抑菌作用，故先采用脱脂棉对供试液进行预过滤[3]，去除沉淀，滤液再采用培养基稀释法验证，稀释剂对照组和5种试验菌的回收率均>70%。③加味黄芩油膏中含黄芩、黄柏、枯矾、轻粉等，具有较强的抑菌活性，因其基质为凡士林，采用乳化剂研磨均匀后也不能通过滤膜，无法采用薄膜过滤法消除其抑菌活性，故将加味黄芩油膏用十四烷酸异丙酯溶解，采用萃取法处理样品，并联合使用培养基稀释法，稀释剂对照组回收率>70%，5株试验菌的回收率>70%。结果见表1。

3.2 控制菌验证

定痫丸采用培养基稀释法检查大肠埃希菌，结果见表2。皮脂搽剂和加味黄芩油膏按“2.1”项下方法处理，采用培养基稀释法检查金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，试验组均可检出，阴性组和空白对照组未检出，满足要求，结果见表3。

4 讨论

定痫丸加稀释剂后振摇30 min（45 ℃、150 r/min），充分崩解，研磨后能分散均匀。制丸之后采用朱砂包衣，其中硫化汞含量较低，采用培养基稀释法（0.5 mL/皿）即可消除其抑菌作用，5种菌回收率均>70%。

皮脂搽剂为含有硫磺、白矾、轻粉的混悬液，溶剂为60%（V/V）的乙醇，制成1∶10供试液后，溶剂性质改变，硫磺不溶于水而析出，这些沉淀一方面有较强抑菌作用，另一方面也影响平皿中菌落的计数。采用500 r/min低速离心5 min，仍有一部分沉淀浮于液面，故考虑用预过滤法进行粗滤去除沉淀。据文献报道，用滤纸过滤，过滤后菌液浓度降低70%～80%，影响样品中微生物的检出；用无菌脱脂纱布和脱脂棉过滤，过滤前后菌液的浓度基本保持一致，但纱布对微小悬浮物的滤除作用差[4]。故本试验采用脱脂棉进行预过滤，而后滤液用培养基稀释法进行检查，回收率能够达到70%以上。

加味黄芩油膏以凡士林为基质，含轻粉、石膏、冰片、枯矾及黄芩提取液等，具有较强的抑菌活性。曾采用中和法和培养基稀释法，均不能完全消除抑菌活性。这类以凡士林、羊毛脂等为基质的软膏剂应尽量避免使用薄膜过滤法，因为油脂性基质过膜困难，很容易堵塞滤膜。故采用十四烷酸异丙酯溶解样品，pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液萃取出样品中的微生物，作为供试液，再联合培养基稀释法，可消除加味黄芩油膏的抑菌活性，5株菌的回收率满足要求。

含重金属制剂的微生物限度检查，可优先选择中和法或培养基稀释法，重金属含量高或还有其他抑菌成分的制剂可联合使用培养基稀释法、薄膜过滤法、萃取法等。定痫丸、皮脂搽剂和加味黄芩油膏分别为丸剂、搽剂和软膏剂，本研究选取这3种具有代表性的制剂进行研究，为含有重金属、具有抑菌活性制剂的微生物限度检查方法的选择提供了参考依据。

参考文献：

[1] 徐韬，徐先祥，林小凤，等.朱砂与石膏体外抑菌作用研究[J].中国民族民间医药，2011，20（23）：57-58.

[2] 陆继梅，孟建华，安立，等.红粉、轻粉体外抗菌作用实验研究[J].新中医，2012，44（7）：157-158.

[3] 苑思坤，李玉芝，王红云.微生物限度检查薄膜过滤法供试液预处理方法探讨[J].中国药业，2010，19（18）：42-43.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

（收稿日期：2015-08-13）

（修回日期：2015-09-01；编辑：陈静）