酒曲中高产蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的筛选与分子鉴定

王鹏昊，关统伟，邓奥宇，田　蕾，董　丹，赵小林（.西华大学微生物研究所，四川成都6009；.四川农业大学资源环境学院，四川成都60；.成都蜀之源酒业有限公司，四川成都65）



酒曲中高产蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的筛选与分子鉴定

王鹏昊1，关统伟1，邓奥宇1，田蕾2，董丹1，赵小林3
（1.西华大学微生物研究所，四川成都610039；2.四川农业大学资源环境学院，四川成都611130；3.成都蜀之源酒业有限公司，四川成都611335）

摘要：白酒酒曲中的蛋白酶和α-淀粉酶在酒类的糖化发酵过程中起到了重要作用，能够有效地水解原料，加快发酵速率。对从酒曲中获得的30株霉菌进行蛋白酶和α-淀粉酶产生菌的筛选，结果表明，产蛋白酶的菌株有15株，占全部测试菌株的50%；产α-淀粉酶的菌株有9株，占全部测试菌株的30%。其中菌株Y27具有最好的蛋白酶活（酶活性为324.72 U/mL）和α-淀粉酶酶活（225.76 U/g干曲）。因此，Y27菌株具有很好的酿酒开发潜力。系统发育分析表明，菌株Y27与Aspergillus oryzae同源性最高，其序列相似性为99.8%。此研究为米曲霉应用于酿酒工业提供了思路。

关键词：酒曲；霉菌；蛋白酶；α-淀粉酶；米曲霉

优先数字出版时间：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1628.023.html。

酒曲是微生物的培养物，是白酒生产中的糖化剂、发酵剂、产香剂，有“酒之骨”之称［1］。酿酒的糖化过程，是酒曲中蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的协同作用的结果［2］。其中酒曲中的蛋白酶和α-淀粉酶在酿酒过程中更是起到至关重要的作用。蛋白酶是分解蛋白质肽键一类水解酶的总称。它能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒间质细胞壁的结构，使原料中可利用的碳源增加；同时由于蛋白质的水解作用，提高了发酵料中氨基态氮的含量，促进酵母生长繁殖，加快发酵速率。α-淀粉酶能迅速水解α-1，4葡萄糖苷键，将庞大的淀粉分子断裂成较小分子，使淀粉浆黏度急速降低，生成糊精及少量麦芽糖和低聚糖进入下一步的发酵过程中。所以在白酒生产过程中不能忽视蛋白酶与α-淀粉酶的作用，从酒曲中选育出高产蛋白酶和α-淀粉酶的功能优质霉菌应用于酿酒工业，将极大改善酒曲性能，提高酒的质量和产率，缩短生产周期，降低生产成本，还可将功能菌应用于相关领域，造福人类社会［3-7］。因此，本研究是通过实验对酒曲中的真菌菌株进行分离、筛选与鉴定，希望从中得到产酶活力高的优良菌株，为白酒生产提供新的材料。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

从四川泸州、宜宾、邛崃、大邑等地酒厂的酒曲中分离纯化了30株霉菌，分别编号为Y1—Y30，用于蛋白酶和α-淀粉酶的筛选。

Aspergillus oryzae苏- 16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株由成都蜀之源酒业有限公司提供。

1.1.2主要培养基［8］

查氏培养基：蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，琼脂15 g，蒸馏水1000mL，pH6.0～6.5。

酪蛋白培养基：酪蛋白15 g，Na2HPO42 g，NaCl 5 g，琼脂15 g。

发酵培养基：麦麸∶水=1∶1（质量比），自然pH值。

淀粉琼脂培养基：蛋白10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，琼脂15 g，蒸馏水1000mL，pH4.0。

固态产酶培养基：麸皮8 g，豆饼粉2 g，MgCl20.1%，水10mL。

1.1.3主要试剂与试剂盒

0.4mol/L三氯乙酸：称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解定容至1000mL。

0.5mol/L NaOH溶液：按GB601配制。

1mol/L HCl：取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02 g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5 g，加水溶解并定容至1000mL。

10 g/L酪素溶液：称取酪素1.000 g，精确至0.001 g。用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入缓冲溶液约80mL。边加热边搅拌，直到完全溶解。冷却后，转入100mL容量瓶中。用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。

100μg/mL L-酪氨酸标准溶液：称取L-酪氨酸0.1000 g。用60 mL1mol/L盐酸定容。吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容到100mL。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

1.2实验方法

1.2.1产蛋白酶菌株的筛选

初筛：采用酪蛋白平板水解透明圈法，将分离纯化后的菌株点种于酪蛋白培养基平板，于恒温箱内培养48h，挑取产生水解透明圈的菌落，测定L值（L值=透明圈直径/菌落直径）后，4℃保存备用。

复筛：经初筛得到产生透明圈的菌株，吸取1mL孢子悬液（108个/mL）接种于发酵培养基中，搅拌均匀，自然pH值，于30℃的培养箱中培养72h后测定蛋白酶活力。

酶活力测定：取待测酶液。40℃恒温水浴2min，加入酪素2mL（摇匀），40℃恒温水浴10min，然后加入三氯乙酸4mL（摇匀），离心取上清液，测OD275nm值。同时作空白对照。对酶活力的规定：温度在40℃时，1mL酶液1min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸量，将此定义为1个蛋白酶活力单位。

式中：X——样品的酶活力（U/mL）；

A——试样溶液的平均吸光度；

K——吸光常数；

8——反应试剂的总体积（mL）；

2——吸取酶液2.00mL；

1/10——反应时间10min，以1min计；

n——稀释倍数；

E——中性蛋白酶系数为0.50。

1.2.2 α-淀粉酶产生菌株的筛选

初筛：把菌株接种到已灭菌的淀粉琼脂培养基上，30℃静置培养2～3d后，转接入装有25mL该培养基的液体三角瓶中，以30℃、150r/min摇床培养24h。取1mL培养液用无菌水梯度稀释，各取0.15mL菌悬液分别涂布于平板分离培养基，30℃培养3d，在平板上喷洒碘液，将有透明圈的单菌落挑出，进一步划线分离后，挑至斜面保藏培养基上，30℃培养3d，于4℃下保存。

复筛：取1环初筛菌种接入种子培养基，于30℃、150r/min摇床培养24h。取1mL接入固态产酶培养基，于30℃恒温培养72h后测定α-淀粉酶酶活，并于4℃下保存活性最佳的菌种。

酶活的测定方法：取底物5mL在40℃水浴预热10min，加入0.5mL酶液，准确保温5min，取0.5mL混合液加入5mL0.1mol/L的H2SO4终止反应，从中取0.5mL加入5mL稀碘液显色，在660nm处测定吸光值。以0.5mL缓冲液代替0.5mL的酶液为对照，以蒸馏水作为比色的空白。

酶活力（U/g）=（R0-R）×1000×10/［R0×T×V×（1-β）］

式中：R0、R代表对照和反应液的光密度；m为底物中含淀粉的质量；T为反应时间；V为酶液的体积；β为含水率。

1.2.3菌株产酶酶活稳定性研究

α-淀粉酶和蛋白酶的耐酸性研究：配制不同pH值的可溶性淀粉溶液，40℃下分别测定酶活性考察酶的耐酸性。所用的缓冲体系：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH2.2～8.0）、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0～10.0）。

α-淀粉酶和蛋白酶的耐高温性研究：酶在不同温度下的失活速率不同，随温度的升高，失活速率加快。本实验在适宜的pH值条件下分别在不同温度下（30～60℃）测定酶活性，考察酶的耐高温性。

1.2.4菌株的分子鉴定

（1）霉菌DNA的提取与聚合酶链反应（PCR）扩增采用真菌试剂盒提取菌株DNA基因组，按照试剂盒说明书操作。真菌试剂盒购自上海生物工程公司。

根据真菌18S rDNA保守区设计引物，上游引物PA：（5'- GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3'）和下游引物PB：（5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'），由上海生物工程公司合成。

PCR扩增的反应体系（15μL）：样品DNA 0.6μL、上游引物0.6μL、下游引物0.6μL、2×Master Mix Taq酶7.5μL，无菌重蒸水补足至15μL。采用真菌常规的PCR反应程序进行。

（2）系统发育分析［9］

送上海生物工程公司进行序列测定，然后用BLAST程序将所测的序列与NCBI GenBank数据库进行同源性分析；选择相应参比菌株序列，采用MEGA 6.0软件及Tamura K等的方法构建系统发育树［10］。

1.2.5菌株与Aspergillus oryzae苏-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株性能比较

米曲的制备：取优质大米淘米2min，浸泡15h，使其含水量在28%～32%。蒸米45min，蒸熟后保持含水量在44%左右。将蒸熟的米灭菌30min，放入无菌室冷却至31℃，然后按照千分之二的质量比接入菌株孢子悬浮液。将接种后的米曲放入培养箱中进行培养，当曲温升至42℃时，调节培养箱温度，使其维持在42℃左右。培养48h后取出烘干备用。该米曲的水分的测定采用烘干法；糖化力的测定采用DNS比色法，即糖化力以1 g绝干曲在pH4.6的条件下，50℃作用1h能糖化可溶解性淀粉的毫克数表示。液化力的测定采用碘反应法，即液化力以1 g绝干曲在pH4.6的条件下，35℃作用1h能液化可溶解性淀粉的克数表示。酸性蛋白酶测定采用福林法，酸性蛋白酶酶活即在40℃条件下每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

2结果与分析

2.1产蛋白酶菌株的筛选结果

2.1.1初筛

从30株霉菌中初筛得到产生酪蛋白水解圈菌株共15株，占全部测试菌株的50%。初步测定其L值（见表1），数据显示，其中菌株Y27的L值最大，为3.01。

表1产蛋白酶菌株初筛

2.1.2复筛及酶活测定

将挑选出L值较大的5株菌，发酵培养后测定其蛋白酶活性（见表2），5株菌中，L值和酶活都较大的菌株是Y27，分离至浓香型白酒酒曲，其L值为3.01，蛋白酶活是324.72 U/mL。

表2菌株的复筛

2.2α-淀粉酶产生菌株的筛选

经产淀粉酶实验发现，共有9株菌产α-淀粉酶，占测试菌株的30%。进一步复筛发现，Y8、Y20和Y27产α-淀粉酶活力较好，其中Y27菌株产酶较高，酶活达到225.76 U/g，其中酶活较低的是Y30菌株，酶活为67.9 U/g，结果见表3。

表3 α-淀粉酶活性测定结果

综合比较供试菌株的产酶能力，则蛋白酶和α-淀粉酶活性最高的是菌株Y27。为了确认该菌株是否适合用于酒曲的制备和是否适合酒精发酵，Y27菌株的耐酸性、耐高温性研究被进一步实施。

2.3Y27菌株产酶酶活稳定性研究

调节培养基pH值为2.0～9.0，考察蛋白酶和α-淀粉酶的相对活性，结果见图1。

图1酶的耐酸性

图1表明，α-淀粉酶在pH值为4.0～8.0时可以保持较高的酶活力，其中最高酶活力在pH值为5.5，当pH值为4.0时，该酶仍然具有最高活性的70%；当pH值为3.0时，α-淀粉酶仍然具有最高活性的45%；说明α-淀粉酶具有一定的耐酸性。对于蛋白酶而言，在pH值为3.0～6.0时保持较好的酶活力，其中pH值调至4.5时，活性达到最大；而当pH值超过7.0时，蛋白酶相对活性迅速下降至40%左右。表明蛋白酶在酸性条件下酶活稳定，能够发挥良好的酶解作用。

图2酶的耐高温性

在调节培养基pH值至最佳的基础上考察酶的耐高温性，结果（图2）表明，当温度控制在30～50℃时，蛋白酶可以保持较高的酶活性，其中在40℃时蛋白酶活性最高；当温度升高至50℃时，蛋白酶活性仍为最高值的72%左右，当温度升高至55℃时，蛋白酶活性才降为最高值的60%左右。对于淀粉酶而言，当温度达到50℃时，α-淀粉酶活性最高；在30℃时仍可以维持60%的酶活力，当温度升高至60℃时，α-淀粉酶活性才下降明显。从图2可以知道，菌株Y27产出的这2种酶对温度和酸度都有一定的耐受性，表现出较好的适应能力，适合白酒的酿造生产。

2.4Y27菌株的鉴定

经过序列的Blast比对显示，菌株Y27属于曲霉属的一个种。利用MEGA6.0软件构建系统发育树（图3），其与Aspergillus oryzae RIB40序列相似性最高，达到了99.8%，结合形态特征，我们确定Y27菌株为米曲霉Aspergillus oryzae RIB40。

图3系统发育树

2.5不同菌株酶系状况比较分析

Aspergillus oryzae苏-16是从自然培养麦曲中筛选出的优良菌株，用该菌种制成的麦曲来酿造黄酒，有原有黄酒的风味特色，因而黄酒行业普遍使用。Aspergillus oryzae IFO 30113菌株是日本清酒酿造中的常用菌种，将Y27菌株与二者性能比较，可以对Y27菌株的应用作进一步分析判断。

采用不同菌株接种的米曲，其比较结果见表4。

由表4可知，接种Y27菌株孢子悬浮液的米曲其糖化力为1267 mg/g·h，其液化力为2.41 g/g·h，均比Aspergillus oryzae苏-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株略高，说明Y27菌株对淀粉的利用能力比Aspergillus oryza 苏-16、Aspergillus oryzae IFO 30113菌株更强，适合白酒的酿造生产；其酸性蛋白酶活力（210 U/g）也比Aspergillus oryzae苏-16（185 U/g）、Aspergillus oryzae IFO 30113（194 U/g）较高，因此具有很好的开发应用前景。

3　结论

蛋白酶和α-淀粉酶在酒类的糖化发酵过程中起着重要作用，为此对从白酒酒曲中获得的30株霉菌进行筛选，获得1株高产蛋白酶和淀粉酶且酶活性能稳定的菌株Y27。通过18S rDNA系统发育分析显示，Y27与米曲霉（Aspergillus oryzae）在进化关系上同源性最高，达到了

表4不同菌株酶系状况比较分析

99.8%。据统计，至今为止，还没有关于米曲霉酿酒的相关报道，但菌株Y27具备的酶活高且在酸性和高温条件下的稳定为工业化生产新型白酒提供了独特的发酵菌种资源。这些优质的菌株有望提高酒的质量和产率，缩短生产周期，降低生产成本。因此，Y27也是一株具有巨大开发潜力的工业菌株，其应用前景广阔。本研究为米曲霉在酿酒行业的应用提供了借鉴，为米曲霉在白酒制曲生产中的应用奠定了理论基础。

参考文献：

［1］傅金泉.中国酒曲技术的发展与展望［J］.酿酒，2002，29（2）：7-9.

［2］徐颖宣，徐尔尼，冯乃宪，等.微生物混菌发酵应用研究进展［J］.中国酿造，2008（9）：1-4.

［3］范光先，王和玉，崔同弼，等.茅台酒生产过程中的微生物研究进展［J］.酿酒科技，2006（10）：75-77.

［4］吴衍庸.白酒工业微生物资源的发掘与应用［J］.酿酒科技，2006（11）：111-113.

［5］蒲岚，李璐，谢善慈，等.浓香型白酒窖池中糟醅微生物的变化趋势研究［J］.酿酒科技，2011（1）：17-19.

［6］孙剑秋，刘雯雯，臧威，等.酱香型白酒酒醅中霉菌群落组成与功能酶活性［J］.中国食品学报，2013（8）：239-247.

［7］张建敏，黄永光，周文美，等.传统白酒固态发酵过程中放线菌的研究进展［J］.酿酒科技，2013（10）：73-79.

［8］无锡轻工业大学.微生物学［M］.北京：中国轻工业出版社，2002.

［9］李德林，张宿义，毛振宇，等.PCR-DGG对浓香型白酒糟醅微生物群落结构解析［J］.酿酒科技，2014（3）：25-31.

［10］Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0［J］.Mol Biol Evol，2013，30：2725-2729.

Screening and Molecular Identification of Fungal Strains with High-Yield of Protease and α-Amylase

WANG Penghao1，GUAN Tongwei1，DENGAoyu1，TIAN Lei2，DONG Dan1and ZHAO Xiaolin3

（1.Research Institute of Microbiology，Xihua University，Chengdu，Sichuan 610039；2.College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130；3.Shuzhiyuan Distillery Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan 611335，China）

Abstract:Protease and α-amylase in liquor starter play important roles in the process of saccharification and fermentation.They could effectively hydrolyze raw materials and accelerate fermenting rate.In this study，30 mold strains isolated from starter underwent protease-producing &α-amylase-producing screening.The results suggested that，there were 15 protease-producing strains，50%of total strains；and there were 9 α-amylase-producing strains，30%of the tested strains.Among them，strain Y27 had the best protease activity（up to 324.72 U/mL）and α-amylase activity（up to 225.76 U/g dry yeast）.Therefore，strain Y27 had good development potentials.Phylogenetic analysis showed that strain Y27 and Aspergillus oryzae had the highest homology with their sequence similarity as 99.8%.This study provided new thoughts for the application of Aspergillus oryzae in liquor-making industry.

Key words:starter；mold；protease；α-amylase；Aspergillus oryzae

中图分类号：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0061-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015405

基金项目：教育部春晖计划项目（No.Z2012022）；西华大学重点科研基金项目（No.Z1220530）；食品生物技术四川省高校重点实验室项目（No.Szjj2013-045）和四川省教育厅基金项目（No.13205688）。

收稿日期：2015-10-16修回日期：2016-01-18

通讯作者：关统伟，男，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为微生物系统学与食品发酵工程。