EGFR核内迁移与食管癌顺铂耐药的相关性研究

崔月龙王 博姬颖华路 平*（ 濮阳市安阳地区医院放疗科，河南 濮阳 455000； 新乡医学院第一附属医院肿瘤科，河南 新乡 453000）



EGFR核内迁移与食管癌顺铂耐药的相关性研究

崔月龙1王 博2姬颖华2路 平2*
（1 濮阳市安阳地区医院放疗科，河南 濮阳 455000；2 新乡医学院第一附属医院肿瘤科，河南 新乡 453000）

【摘要】目的 分析表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在食管鳞癌中的表达，并探讨其细胞核内迁移与食管癌顺铂耐药之间的相关性。方法 ①用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测10例顺铂化疗敏感者食管癌组织标本（敏感组）、10例顺铂化疗耐药食管癌组织标本（耐药组）EGFR表达情况及其与顺铂化疗耐药的关系；②用免疫组化法检测食管癌标本及其细胞株EGFR的表达情况；③用顺铂干预食管癌EC9706细胞，并用荧光显微镜观察细胞核内EGFR的表达情况；结果 ①顺铂耐药组食管癌组织中EGFR的表达率显著高于顺铂化疗敏感组（P＜0.05）。②EC-9706细胞膜上EGFR高表达。③顺铂干预后EC9706细胞核内EGFR表达增高。结论 EGFR核内迁移与食管癌顺铂化疗耐药可能有关。

【关键词】食管癌；表皮生长因子受体核内迁移；顺铂耐药；逆转录聚合酶链式反应

中国是世界上食管癌发病率及病死率最高的国家之一，全球每年新增30万食管癌患者中，约有一半发生在中国［1］，且多数食管癌确诊时已经属于中晚期［2］，错过手术治疗的时机，因此化疗就成为中晚期食管癌主要的治疗手段之一。顺铂是食管癌化疗一线用药，但耐药严重影响其疗效。新近研究表明核内EGFR与化疗疗效相关，可能影响耐药。有一项鼠实验结果已经证明顺铂可以促使EGFR向核内转移，并且顺铂引起的DNA损伤可以通过EGFR核内转移得到修复［3］。因此，本实验通过检测EGFR在食管癌耐药组及敏感组的表达及观察顺铂干预食管癌EC9706细胞核内EGFR的表达情况，探讨EGFR核内迁移与食管癌顺铂耐药的关系。进而为逆转顺铂耐药和寻找新的基因靶点提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源：选取2010年6月至2012年10月新乡医学院第一附属医院收治的Ⅱ～Ⅲ期食管癌病例共20例。入选标准：①在我院初治，病理确诊为鳞状上皮细胞癌。②取肿瘤组织标准前没有接受过放疗。③术后均接受单药顺铂化疗。④有详细的临床病理资料。

1.2 试剂：食管癌细胞EC-9706、EC-1细胞（新乡医学院神经病学实验室提供），EGFR兔单抗（Cell Tignaling Technology），山羊抗兔（Cell Tignaling Technology），顺铂（江苏豪森），Trizol试剂（Invitrogen）；AMV Reverse Transcriptase （Themo Scientific）；RT-PCR试剂盒购于天跟公司；PCR引物购于生工生物（上海）股份有限公司；无水乙醇、氯丙醇、氯仿 国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 荧光实时定量PCR检测两组中EGFR的表达：Trizol法提取两组中食管癌组织的总RNA。用紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，其A260/280比值在1.8～2.0。取上述RNA 1 μg（按RNA浓度的换算取用），采用AMV Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA。设计相应的PCR引物序列，采用SYBR green作为荧光染料，以U6snRNA为内参进行标准化，应用Bio-Rad CFX96定量PCR仪进行荧光实时定量PCR。反应体系为总体积20 μL，其中cDNA 模板2 μL、dNTP Mixture0.8 μL、上游引物，10 mmol/L 0.5 μL、下游引物，10 mmol/L 0.5μL、cDNA模板2 μL、Taq 酶0.2 μL、RNase Free dH2O15 μL。PCR循环条件为：第一步：94 ℃预变性1 min，第二步：94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min共40个循环，溶解曲线分析稳定为（70～95 ℃）。为保证实验的可靠性，所有标本均至少重复一次PCR反应。

1.3.2 免疫组化法选择EGFR高表达食管癌细胞EC-9706。分别取对数生长期EC-9706细胞、EC-1细胞，胰酶消化后计数，在载玻片上划定区域，细胞悬液种于载玻片上，载玻片四周滴0.01 mol/LPBS溶液防止培养基挥发。24 h后待细胞贴壁，洗去多余的培养基，PBS冲洗后用4%多聚甲醛固定40 min，3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶，滴加一抗稀释液，于4 ℃冰箱过夜，加二抗，DAB显色。显微镜观察两组细胞细胞膜EGFR表达情况。

1.3.3 用顺铂干预食管EC-9706细胞，观察用药前后细胞核内EGFR的表达情况。取对数生长期EC-9706细胞，胰酶消化后计数，重悬细胞于完全培养基中（6孔板），细胞爬片，2孔一组，分为空白组和对照组；对照组细胞生长48 h后加入顺铂（浓度为50 μmol/L）作用12 h；两组均0.01 mol/PBS溶液洗涤5 min×3次，4%多聚甲醛固定40 min，0.01 mol/PBS溶液洗涤5 min×3次，加入0.1%TritonX-100通透10 min，0.01 mol/PBS溶液洗涤5 min×3次，10%山羊血清封闭30 min，勿洗，加入一抗（EGFR兔单抗1∶70）4 ℃潮湿环境下避光18 h，0.01 mol/PBS溶液洗涤5 min×3次加入荧光素标记二抗（山羊抗兔）室温作用2 h（避光），0.01 mol/PBS溶液洗涤5 min×3次加入50%甘油封片；荧光显微镜下观察细胞，空白组、对照组细胞核内的EGFR表达情况。

1.4 统计学分析：应用SPSSl6.0统计软件，数据以均数士标准差（±s）表示，在检验数据正态分布及方差齐性的条件下，采用方差分析进行两组间数据比较，P值＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组标本中EGFR表达：耐药组中EGFR的表达明显高于敏感组。差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

2.2 免疫组化法选择EGFR高表达食管癌细胞EC-9706，实验结果显示EGFR在EC-9706细胞膜上高表达。见图2、3。

2.3 顺铂干预后核内EGFR的表达情况：顺铂干预后，核内EGFR的表达明显高于干预前，提示顺铂化疗能诱导食管癌细胞EGFR核内迁移。见图4、5。

表1 RT-PCR检测两组中EGFR表达的水平（±s）

表1 RT-PCR检测两组中EGFR表达的水平（±s）

注：t=-4.12，P=0.001，P＜0.01

组别　EGFR的相对表达量（相对内参）敏感组　4.31±0.95耐药组　0.36±0.22

图1 敏感组与耐药组中EGFR的相对表达量比较　

图2 EC-9706

图3 EC-1

图4 空白组核内EGFR未见明显表达

图5 对照组核内EGFR较空白组明显增多

3 讨 论

食管癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，治疗以手术为主辅以放化疗综合治疗，但复发率高，临床研究发现，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致食管癌综合治疗失败的关键因素。食管癌的发生就是一个多基因变异累计的过程［4］，耐药产生的机制非常复杂，是多基因、多步骤作用的结果。其中DNA修复机制在顺铂耐药中起重要作用，ERCC1是DNA修复的主要基因，但其与顺铂耐药性不成直线关系［5］。表皮生长因子受体（EGFR）是一种据有酪氨酸激酶活性糖蛋白，相对分子质量170 kDa，位于染色体7q12，在人类恶性肿瘤中普遍过度表达。EGFR为跨膜受体，由胞外的配体结合区域和细胞内的酪氨酸激酶活性区域组成。EGFR的胞外结合区与相应的配体结合，通过RAS/RAF/MEK、PI3K/AKT、PLCγ/PKC、SRC激酶和STAT等信号通路，从而调控细胞核内相关转录因子的活性发挥相应的生物学，包括细胞的增殖、存活、凋亡、侵袭等方面［6］。研究表明除了这些传统的胞质信号传导通路外，EGFR在原发肿瘤细胞中和其他的一些高增值组织的细胞核内被持续监测到［7］。临床研究显示，肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胶质瘤以及头颈部恶性肿瘤等肿瘤都有一定程度EGFR高表达，并与患者的病情进展、放化疗敏感性以及预后相关［8］。本研究首先从基因水平上分析EGFR在敏感组及耐药组的核内表达情况，结果表明：EGFR在耐药组的核内表达明显高于敏感组（P＜0.05）。其次用免疫组化方法观察EGFR在食管癌细胞EC9706 和EC1细胞的表达情况，显示EGFR在食管癌细胞EC-9706细胞膜呈高表达。再次在细胞学水平上用荧光显微镜观察顺铂干预食管EC-9706细胞核内EGFR的表达情况，显示顺铂化疗能诱导食管癌细胞EGFR核内迁移，即上述结果表明EGFR在食管癌组织中有恒定的表达，并且核内表达水平与食管癌顺铂化疗耐药有关，这可能是EGFR核内易位促进化疗损伤后DNA的修复有关。EGFR表达阳性的肿瘤具有更强的转移力和侵袭性，对放疗化疗不敏感，复发率高，生存期短。Park SJ等研究结果显示：肿瘤细胞过度表达EGFR时显示耐药性增加［9］，与本研究结果较一致。总之，EGFR核内转移与顺铂化疗耐药有关。这对于阐明顺铂耐药机制，提供逆转耐药靶点、提高食管癌的化疗疗效及改善预后意义重大。

参考文献

［1］ Home RS，Vaughan TL.Epidemiology and pathogenesis of esophageal cancer ［J］.Semin Radiat Oncol，2007，17:2-9.

［2］ Stein HJ，Sendler A，Fink U，et al.Multidisciplinary approach to esophageal and gastric cancer［J］.Surg Clin North Am，2000，80:659-682.

［3］ Liccardi G，HartleyJA，Hochhauser D.EGFR nuclear translocation modulates DNA repair following cisplatin andionizing radiation treatment［J］.Cancer Res，2011，17（3）:1103-1114.

［4］ Kamangar F，Dores GM，Anderson WF.Patterns of cancer incidence ，mortality，and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world［J］.J Clin Oncol，2006，24（14）:2137-2150.

［5］ 李代蓉，杨燕青，田玲，等.DNA修复基因多态性与肺癌顺铂化疗敏感性的研究［J］.肿瘤，2011，4（31）:348-353.

［6］ Shin HK，Kim MS，Lee JK，et al Combination effect of cetuxim ab with radiation in colorectal cancer cells［J］.J Tumori，2010，96（5）:713-720.

［7］ Bitler BG，Goverdhan A，Schroeder JA.MUC1 regulates nuclear localization and function of the epidermal growth factor receptor［J］. J Cell Sci，2010，123（pt10）:1716-1723.

［8］ Blume-Jensen P，Hunter T.Oncogeneic kinase signaling［J］. Nature，2001，411:355-365.

［9］ Park SJ，Armstrong S，Kim CH，et al.Lack of EGF receptor contributes to drug sensitivity of human germline cells［J］.Br J Cancer，2005，92（2）: 334-341.

中图分类号：R735.1

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）10-0126-02

*通讯作者