普罗布考对动脉粥样硬化兔的高密度脂蛋白逆转运功能中酶蛋白和受体的影响

钟建开,吴焱贤,陈盈文,李琛,黎文生,郭志刚



基础与实验研究

普罗布考对动脉粥样硬化兔的高密度脂蛋白逆转运功能中酶蛋白和受体的影响

钟建开,吴焱贤,陈盈文,李琛,黎文生,郭志刚

摘要

目的：探讨普罗布考对动脉粥样硬化（AS）兔的高密度脂蛋白逆转运功能中酶蛋白和受体的影响。

方法：新西兰大白兔（共24只） 随机分为3组：对照组（n=8）：用普通饲料饲养；高脂组（n=8）：用高脂饲料喂养；普罗布考组（n=8）：在高脂饲料的基础上给予普罗布考喂养。饲养12周通过比色法测定血脂，通过酶联免疫吸附法检测血清磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转移蛋白（CETP），并采用免疫组化方法检测主动脉壁斑块内三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）和清道夫受体-BI （SR-BI）表达水平。

结果：实验后第12周（1）血脂指标：与高脂组比较，普罗布考组血清总胆固醇[TC,（15.95±1.51 ）mmol/L vs （21.95±3.71）mmol/L]、低密度脂蛋白胆固醇[LDL-C, （13.01±2.28） mmol/L vs （17.90±3.51）mmol/L]、高密度脂蛋白胆固醇[HDL-C, （0.56±0.10） mmol/L vs（1.13±0.12 ）mmol/L]水平明显下降, 差异均有统计学意义（P＜0.01）。（2）LCAT和CETP：与对照组［CETP（2.07±0.64）μg/ml和LCAT（27.01±8.26）µg/ml]比较， 高脂组[CETP（1.24±0.54）µg/ml和LCAT（15.02±3.81）µg/ml］明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与高脂组比较，普罗布考组［CETP （3.43±1.01） µg/ml和LCAT（38.10±7.96） µg/ml］明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）主动脉壁斑块ABCA1和SR-BI受体表达：与高脂组比较，普罗布考组ABCA1阳性表达的面积（%）显著增加[（46.81±10.01）% vs （24.10±8.48）%，P＜0.01]；SR-B1阳性表达面积（%）亦显著增加[（48.04±10.90）% vs （18.61±6.77）%，P＜0.01]，两组比较差异均有统计学意义。

结论：普罗布考通过增加高密度脂蛋白外周动脉受体ABCA1和SR-BI表达，增加LCAT和CETP的量，促进HDL的RCT功能，从而改善HDL的功能。

关键词 动脉粥样硬化；普罗布考；脂蛋白类，HDL

Objective: To explore the effect of probucol on enzyme and receptors of high density lipoprotein (HDL) during reverse cholesterol transportation in experimental rabbits with atherosclerosis.

Methods: A total of 24 New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups: Control group, the rabbits were fed by normal diet, High cholesterol group, the rabbits were fed by high cholesterol diet and Probucol group, the rabbits were fed by high cholesterol diet with probucol. n=8 in each group, all animals were treated for 12 weeks. Blood levels of lipids were examined by colorimetric method, serum lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) and cholesterol ester transfer protein (CETP) were detected by ELISA, expressions of ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class Btype I (SR-BI) in aortic plaque were measured by immunohistochemistry; the above indexes were compared among different groups.

Results:① for blood lipids by mmol/L, the following indexes in Probucol group were lower than High cholesterol group: TC (15.95±1.51 vs 21.95±3.71), LDL-C (13.01±2.28 vs 17.90±3.51), HDL-C (0.56±0.10 vs 1.13±0.12), all P＜0.01. ② the following perimeters in High cholesterol group were lower than Control group: for CETP by µg/ml (1.24±0.54 vs 2.07±0.64), for LCAT by µg/ml (15.02±3.81 vs 27.01±8.26), all P＜0.05; compared with High cholesterol group, Probucol group had increased CETP (3.43±1.01) and LCAT (38.10±7.96), all P＜0.05. ③ positive expressions of ABCA1 and SR-BI in aortic plaque in Probucol group were higher than High cholesterol group: for ABCA1 by % (46.81±10.01 vs 24.10±8.48), for SR-BI by % (48.04±10.90 vs 18.61±6.77), all P＜0.01.

Conclusion: Probucol may increase blood levels of LCAT, CETP via up-regulating the expressions of ABCA1, SR-B1 and elevating the reverse cholesterol transportation of HDL, therefore improve HDL function in experimental rabbits with atherosclerosis.

Key words Atherosclerosis; Probucol; Lipoproteins; Lipoproteins, High density lipoprotein

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:393.)

高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度与心脑血管病的发病危险呈独立的负相关，血清HDL-C水平每升高1 mg/dl，男性患者冠心病的危险性即降低2%，女性降低3%[1]。与低密度脂蛋白（LDL）增加心血管病风险不同，高密度脂蛋白（HDL）具有心血管保护作用；然而，HDL与动脉粥样硬化（AS）的关系较为复杂，在载脂蛋白A-1（ApoA-1）Milano突变体人群中，其HDL-C的水平较一般人群低，但其冠心病的发生率也明显降低[2]。因此，国内外学者认为血清HDL-C水平并不能反映HDL的整体功能，HDL可以通过多种机制发挥抗AS的功效，包括胆固醇逆转运（RCT）、抗氧化、抗炎、改善内皮细胞功能失调、抗血栓及促纤溶等。普罗布考是一种具有强抗氧化作用的降脂药，能明显降低总胆固醇，但是普罗布考降低总胆固醇的同时，也显著降低了HDL-C的水平。为什么普罗布考降低HDL-C水平后仍能发挥强大的抗动脉硬化效应？这可能和普罗布考改善HDL的RCT功能密切相关，但是普罗布考通过何种机制提高HDL的RCT功能？国内外鲜有报道。本研究通过高脂饮食建立AS兔模型，由此研究普罗布考对卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转移蛋白（CETP）量的影响，对主动脉壁HDL受体三磷酸腺苷结合盒转运体A1 （ABCA1）和清道夫受体-BI （SR-BI）的表达的影响，以探讨普罗布考改善HDL功能的机制。

1 材料与方法

实验动物及分组：选取2011-04到2013-10健康雄性新西兰白兔24只，南方医院实验动物中心提供饲养和观察场地（饲养环境温度约25℃，湿度7%，自动通风器保持室内通风）；单笼饲养，每日总食量约120 g，饮水不限，共饲养12周。随机分为：（1）对照组8只：饲以普通饲料；（2）高脂组8只：饲以高脂饲料；高脂饲料配方：1%胆固醇、8%猪油、0.05%胆盐、其余为正常粗颗粒饲料。（3）普罗布考组8只：饲以高脂饲料的基础上给予普罗布考400 mg/ （kg·d）。12周后通过检测3组兔的血脂浓度，肉眼观察和测定3组兔主动脉内中膜厚度及斑块面积的组织病理学特点，判断普罗布考组和高脂组兔动脉粥样硬化模型构建成功[3]。

血脂测定：新西兰白兔空腹取血5 ml，部分血液立即在奥林巴斯AU5421型全自动生化分析仪上测定血清总胆固醇（TC）、LDL-C、HDL-C、甘油三酯（TG）[4]。部分血液静置30 min后离心取血清，并置于-70℃冰箱保存备用。

CETP和LCAT的测定：采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定LCAT和CETP浓度。按 ELISA 试剂盒说明书描述的操作步骤进行：分别向兔CETP和LCAT单克隆抗体的酶标空中加入血清温育：温育后，分别加入生物素标记的抗CETP和LCAT抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤后加入底物A、B产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深与CETP和LCAT的浓度呈正相关。最后根据标准品的浓度以及对应的光密度（OD）值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

免疫组化方法：（1）常规脱水，包埋，切片，脱蜡后蒸馏水充分冲洗；（2）滴加10%双氧水以灭活内源性酶；（3）滴加复合消化液及抗原修复液；（4）滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液；（5）滴加稀释一抗（根据说明书，ABCA1 1:100，SR-BI 1:1000），在4℃过夜；（6）滴加二抗，20℃～37℃ 20 min；（7）滴加试剂链霉亲和素-生物素复合物（SABC）；（8）ABCA1采用二氨基联苯氨（DAB）显色；SR-BI采用3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）染色：室温显色，镜下控制反应时间；（9）mayor苏木素轻度复染。

图片分析：在电子显微镜下观察标本，用奥林巴斯病理图像分析采集系统采集各个切片标本，然后采用Image-plus 6.0专业图像分析软件分析已采集图像，包括：（1）测量斑块表面积和血管表面积，并计算动脉斑块/血管面积比；（2）测量及分析主动脉壁上ABCA1和SR-B1阳性表达面积百分比。

主要试剂及仪器 ：普罗布考（河北颈复康药业集团有限公司）；Ⅰ抗： A1ABC A1 抗体（中国武汉博士德生物工程有限公司），SR-BI抗体（美国Abcam公司）；Ⅱ抗：羊抗小鼠试剂盒（中国武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色剂，AEC染色剂（中国武汉博士德生物工程有限公司）。LCAT和CETP ELISA试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）。日本奥林巴斯公司产AU-5421型生化自动分析仪，ND-1000 Spectrophotometer型分光光度仪（美国NanoDrop有限公司），Hettich公司的低温冷冻高速离心机，奥林巴斯BX51型电子显微镜及图像采集系统。

统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以±s表示，进行方差齐性检验，单因素方差分析，独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组兔实验前后血脂水平的变化（表1）：实验前各组兔TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），实验基线统一。实验后第12周，与对照组比较，高脂组TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平均升高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。与高脂组比较，普罗布考组兔TC、LDL-C和 HDL-C水平明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。

表1 各组兔实验前后血脂水平的变化 (mmol/L，±s）

表1 各组兔实验前后血脂水平的变化 (mmol/L，±s）

注：与同时间段对照组比较*P＜0. 01；与同时间段高脂组比较ΔP＜0. 01

项目　实验前　实验后第12周对照组 (n=8)高脂组 (n=8)普罗布考组 (n=8)对照组 (n=8)高脂组 (n=8)普罗布考组 (n=8)总胆固醇　1.86±0.17　 1.82±0.17　 1.85±0.19　 2.08±0.58　 21.95±3.71*15.95±1.51Δ甘油三酯　1.06±0.18　 1.14±0.20　 1.08±0.19　 0.91±0.36　 1.66±0.26*　1.48±0.25低密度脂蛋白胆固醇　1.04±0.19　 1.04±0.21　 1.05±0.16　 1.51±0.81 17. 90±3.51*　13.01±2.28Δ高密度脂蛋白胆固醇　0.51±0.13　 0.51±0.12　 0.46±0.10　 0.48±0.12　 1.13±0.12*　0.56±0.10Δ

各组兔实验后第12周CETP和LCAT浓度变化比较（图1、2）： 实验后第12周，与对照组[CETP （2.07±0.64）µg/ml和LCAT（27.01±8.26）µg/ml]比较， 高脂组CETP［（1.24±0.54 ）µg/ml和LCAT （15.02±3.81）µg/ml］明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与高脂组比较，普罗布考组[CETP （3.43±1.01） µg/ml和LCAT（38.10±7.96） µg/ml]明显升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

兔主动脉ABCA1及SR-BI表达及染色阳性表达面积百分比（图3、4和表2）：实验后第12周（采用Image-plus 6.0专业图像分析软件分析和计算免疫组化染色结果）对照组主动脉内因未产生斑块，故无斑块内细胞ABCA1和SR-BI表达；斑块内ABCA1表达为深棕黄色，板块内SR-BI表达为鲜红色。斑块内棕黄色和红色的颜色越深、面积越大，代表ABCA1和SR-BI表达越强烈。与高脂组比较，普罗布考组ABCA1阳性表达的面积（%）显著增加（P＜0.01）；SR-B1阳性表达面积（%）亦显著增加（P＜0.01），差异均有统计学意义。

图1 实验后第12周各组兔胆固醇酯转移蛋白浓度（n=8）

图2 实验后第12周各组兔卵磷脂胆固醇酰基转移酶浓度（n=8）

图3 三磷酸腺苷结合盒转运体A1染色结果：棕黄色为三磷酸腺苷结合盒转运体A1的阳性表达（DAB显色；×100）

图4 清道夫受体-BI染色结果：红色为清道夫受体-BI阳性表达（AEC显色；×100）

表2 两组兔主动脉三磷酸腺苷结合盒转运体A1及清道夫受体-BI阳性表达面积（%，±s）

表2 两组兔主动脉三磷酸腺苷结合盒转运体A1及清道夫受体-BI阳性表达面积（%，±s）

清道夫受体-BI阳性表达面积高脂组 (n=8)　24.10±8.48　18.61±6.77普罗布考组 (n=8)　 46.81±10.01　 48.04±10.90 t值　3.789　4.899 P值　0.008　0.002组别　　三磷酸腺苷结合盒转运体A1阳性表达面积

3 讨论

HDL通过多种机制共同发挥抗AS功能：包括RCT、抗炎、抗氧化、改善内皮细胞功能失调、抗血栓及促纤溶等。而RCT功能是HDL最重要的功能，其负责把血管内膜下细胞内多余的胆固醇通过HDL在经过血液循环途径转移到肝脏，肝脏将胆固醇以胆汁形式分泌进入消化道，多余的胆固醇最后通过粪便排出体外[5]。HDL的RCT过程是一个动态的复杂过程，众多的脂蛋白和酶参与该过程， 首先ApoA-1通过ABCA1受体迅速与机体胆固醇结合并发生酯化作用形成Preβ-HDL，Preβ-HDL在LCAT催化下与游离胆固醇结合形成HDL3， HDL3 在LCAT催化下不断结合游离胆固醇并逐渐形成成熟的HDL2； HDL2经肝细胞SR-BI受体汲取后，将HDL中的胆固醇通过胆汁排泄入消化道。而CETP可将HDL上的酯化胆固醇转移给极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂质（LDL）颗粒，后两者再经肝脏LDL受体摄取，将多余的胆固醇排泄至体外[6]。由此可见，在复杂的RCT过程中，ABCA1、SR-BI受体，LCAT、CETP均起到了极其关键的作用，影响整个RCT过程。

在丹吉尔病患者与ABCA1受体缺失小鼠的成纤维细胞中，ABCA1受体介导胆固醇外流并与脂蛋白结合的能力严重下降，而这些胆固醇聚集和沉淀机体组织中；在ABCA1过度表达的小鼠中，其降低高脂饮食的小鼠的AS发生率[7]。由此可见，ABCA1在RCT过程中起到了重要的作用，外周动脉壁ABCA1受体的表达降低，将减少外周动脉壁斑块细胞胆固醇的外流，从而导致细胞内胆固醇的集聚，促进AS发生。本研究证实：普罗布考上调主动脉壁斑块内细胞的ABCA1表达，可以加速斑块细胞内胆固醇从外周流出，减少胆固醇在血管内皮下集聚，从而发挥了抗AS作用。

SR-BI是RCT功能另外一个重要的受体。研究发现，在SR-BI缺失小鼠中，血清胆固醇升高2倍，形成大量异常大颗粒的HDL，HDL的清除率也明显下降[8]，表明通过SR-BI介导的转运HDL的脂质外流是保护HDL结构和功能必不可少的条件。主动脉壁斑块细胞内SR-BI的表达升高，将增加巨噬细胞内胆固醇的外流，减少细胞内胆固醇的集聚[9]。本研究证实：普罗布考也可以通过提高主动脉壁斑块内细胞SR-BI的表达，促进斑块内游离胆固醇的流出，起到抗AS作用。

LCAT是HDL代谢中的关键酶，维持胆固醇的稳态平衡，同时LCAT在HDL的成熟和代谢中起关键作用，是血浆HDL水平的主要决定因素之一。在LCAT基因过量表达的动物， HDL浓度明显升高，HDL成熟能力增强，能从外周汲取并转运更多的胆固醇至肝脏排泄，降低了动物AS的易感性，具有抗AS的作用[10]，在LCAT基因敲除动物实验发现，其HDL颗粒浓度也大大降低，HDL汲取胆固醇外周胆固醇的能力明显下降，AS易感性明显升高[11]。因此，我们认为，LCAT可以反映HDL在RCT中的成熟能力，其能促进HDL成熟，并在成熟过程中不断汲取外周胆固醇，增加RCT能力。本研究发现：高脂组兔LCAT显著降低，而普罗布考组LCAT明显升高，因此普罗布考通过增加LCAT提高HDL的RCT功能。但本研究中，普罗布考组HDL-C水平降低，可能与普罗布考促进肝脏SR-BI表达更强，加速HDL-C与肝细胞结合，使HDL-C内的胆固醇通过胆汁排泄出机体，减少血液中HDL-C量，但该观点有待进一步的研究加以证明。

CETP 也是HDL代谢的重要转运蛋白之一，CETP与AS 的关系比较复杂，目前存在比较多争议，CETP 转运介导HDL内胆固醇转运至LDL、VLDL并交换 TG，富含 TG 的 HDL2被肝汲取后在水解，并通过胆汁排泄胆固醇，CETP升高有抗 AS 的作用[12，13]。本研究发现：高脂组兔的血清CETP比对照组明显降低，该结果可导致HDL的RCT的效率降低，加速AS的进展，而普罗布考可以显著提高CETP浓度，加速HDL的RCT效率，达到抗AS的作用。

普罗布考通过上调AS兔主动脉斑块内细胞ABCA1、SR-BI的表达，同时通过提高CETP和 LCAT浓度，达到提高HDL的RCT效率。由此可见，普罗布考通过上调HDL的RCT外周动脉受体表达和增加RCT酶浓度达到改善HDL功能，发挥抗AS作用。

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（编辑：梅平）

Effect of Probucol on Enzyme and Receptors of High Density Lipoprotein During Reverse Cholesterol Transportation in Experimental Rabbits With Atherosclerosis

ZHONG Jian-kai, WU Yan-xian, CHEN Ying-wen, LI Chen, LI Wen-sheng, GUO Zhi-gang.
Department of Cardiology, The First People's Hospital of Shunde, Foshan (528300), Guangdong, China
Corresponding Author: GUO Zhi-gang, Email: guodoctor126@126.com

Abstract

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（B2014388）

作者单位：528300 广东省，佛山市顺德第一人民医院 心内科（钟建开、吴焱贤、陈盈文、黎文生）；南方医 科大学附属南方医院 心内科（李琛、郭志刚）

作者简介：钟建开 主治医师 硕士研究生 主要从事血脂和冠心病研究 Email：doctor-zh@qq.com 通讯作者：郭志刚 Email：guodoctor126@126.com

中图分类号：R541

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）04-0393-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.04.019

收稿日期:（ 2015-06-19）