含羞草素对肝癌细胞QGY-7703周期同步化的作用

赵雪芹，任　磊，王大巾，张永明，陶斯杰

(1.浙江理工大学生命科学院，杭州 310018；2.厦门大学材料学院，福建厦门361005)



含羞草素对肝癌细胞QGY-7703周期同步化的作用

赵雪芹1，任磊2，王大巾1，张永明1，陶斯杰1

(1.浙江理工大学生命科学院，杭州 310018；2.厦门大学材料学院，福建厦门361005)

摘要:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。肿瘤的发生发展本质上就是细胞无限制的周期性生长、增殖和分化的失调。细胞同步化是研究肿瘤发生发展及治疗的基础。实验以人肝癌QGY-7703细胞株为研究对象，考察含羞草素阻断对周期同步化的作用。并与胸腺嘧啶脱氧核苷阻断法相对照，研究含羞草素阻断去除后对QGY-7703细胞周期的影响。结果显示：QGY-7703细胞在含羞草素阻断后释放的第10 h进入S期，第20 h进入G2/M期，且最高同步率分别为G1期94.6%，S期86.0%。含羞草素能较好地使肝癌细胞株QGY-7703同步化于G1期和S期。

关键词：含羞草素；肝癌细胞；细胞周期；同步化

0引言

肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一。我国原发性肝癌发病人数占全球的55%，死亡人数占45%。虽然目前以外科手术、放疗、化疗为主的肝癌基本治疗手段取得了一定发展，但由于肿瘤细胞对化、放疗耐受等问题，其疗效甚微。研究发现，肿瘤组织中生长着不同周期时相的肿瘤细胞。绝大多数化疗药物与放疗手段对肿瘤细胞的杀伤作用依赖于细胞周期特异性。喜树碱、丝裂霉素、氮芥、氟脲嘧啶为S期特异性[1-3]，而长春新碱、泰素和放疗具有G2/M期特异性[4]。如何安排放、化疗的时程，最大化治疗效果，仍是临床上有待解决的问题。

细胞同步化是研究肿瘤发生发展及治疗的基础。同步化后再使用放疗或化疗药物作用于肿瘤，能够起到协同增效作用。沙利度胺能够增强X射线对胶质瘤U251细胞敏感性[5]。姜黄色素显著提高人前列腺癌、胃癌细胞株SGC-7901与直肠癌的放疗敏感性[6-8]。曲智锋等[9]利用多西他赛联合奥沙利铂同步化放疗局部晚期非小细胞肺癌，提高了临床治疗效果。此外，王雪卿等[10]发现同步化能加强紫杉醇对肿瘤细胞的作用效果以及逆转其耐药性。故此，利用同步化试剂，合理安排放疗、化疗的时程，能达到最佳治疗效果。

含羞草素(L-mimosine)是从含羞草或银合欢中提炼的植物氨基酸。它具有与胸腺嘧啶高度相似的化学结构，可竞争性地与腺嘌呤结合[11-12]，从而阻碍DNA的合成，使细胞阻滞在G1/S点。研究表明含羞草素能将PC-3细胞阻滞在G1期，LNCaP细胞阻滞在S期[13]。同时，含羞草能够抑制K562，7402等多种肿瘤细胞生长，并可其诱导凋亡[14-15]。鉴于此，本研究以含羞草素作为DNA合成抑制剂，从细胞周期角度出发，探讨肝癌细胞QGY-7703对含羞草素的敏感性，并对比胸腺嘧啶脱氧核苷(简称胸苷)阻断法，研究含羞草素阻断去除后对QGY-7703细胞周期的影响。

1材料与方法

1.1实验材料与设备

RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗和胰酶为美国Hyclone公司产品。含羞草素(L-mimosine，AR)购于美国Acros Organic公司。胸腺嘧啶脱氧核苷(TdR，AR)、碘化丙啶(PI，AR)，曲拉通X-100(Triton X-100，AR)和胰核糖核酸酶(RnaseA)为美国Sigma公司产品。流式细胞仪为美国BD公司FACSVantage SE型产品。QGY-7703细胞株为本室保存的，来源于上海细胞库的细胞。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养

将肝癌细胞株QGY-7703接种于RPMI-1640培养基(含100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素和10%胎牛血清)。于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中进行培养。48～72h传代1次。

1.2.2细胞同步化方法

a) 含羞草素阻断法：用含300 μM含羞草素的培养液培养24h，弃去培养液，PBS清洗2次除去残余药物，换正常培养基继续培养若干小时，以流式细胞术(FCM)检测药物去除后细胞的同步化程度。

b) 胸苷单阻断法：加入含2 mM胸苷的1640培养液处理24h后，除去培养液，PBS清洗数次，再将细胞放在含有10%小牛血清的1640培养液中继续培养设定时间。每隔2h收集细胞。收集的细胞用PBS洗涤后以预冷的70%乙醇固定细胞，放置于4 ℃冰箱过夜。

1.2.3细胞周期检测

用FCM检测QGY-7703细胞不同时相的DNA含量。向收集的各组样本中，加入2 mL预冷的70%乙醇固定细胞过夜。检测前，离心去乙醇，PBS清洗后加入0.5 mL碘化丙啶染料(50μg/mL PI, 100μg/mL RNaseA, 0.2% Trixon-100)，室温避光染色30 min，收集碘化丙啶荧光信号。使用CellQuest软件分析细胞各周期时相比率。

2结果分析

2.1含羞草素作用后细胞同步化结果

本实验将含羞草素作用于人肝癌QGY-7703细胞株，研究其对QGY-7703细胞株的同步化作用效果。以FCM检测DNA荧光标识细胞各时相的变化。

单次含羞草素阻断后各时点的流式图见图1。从图1可看出：含羞草素同步化处理后的绝大部分细胞被阻断在预期的时相，而未加药物处理的对照组细胞中处于预期时相的细胞比例较低，大多数处于非同步化生长状态。又由图1(a)知，未同步化的QGY-7703 细胞各时相分别为G1期占65.8%，S期占20.7%，G2/M期占12.7%。通过计算可得出：细胞G1期时长为13.2 h， S期为4.1 h，G2/M期为2.5 h。

图1　含羞草素作用QGY-7703细胞后不同时点的流式周期分布

为了便于观察各周期时相的变化规律，将多次同步化结果汇总成图2。可发现：含羞草素处理细胞24h后，各周期时相所占的百分率依次由少量向高峰过渡。在含羞草素作用结束后的第0h，G1期与S期细胞比率占到总数的90%，这说明大多数QGY-7703细胞被阻断在G1期末(图1(b))；继续培养8 h后，G1期细胞逐渐减少，S期细胞逐渐增多，第8 h 细胞G1期达到最大值，为96.4%(图1(c))，且在第0～10 h内保持80%以上同步率；第20 h细胞S期达到最大值为82.9%；随后G2/M期细胞逐渐增加。这表明含羞草素能够可逆的作用于QGY-7703细胞，并可获得同步化效果较好的 G1期和S期细胞。此外，由含羞草素处理后的G1期曲线可发现，G1期最高值94.6%与最低值7.9%分别出现在去除药物后的第8h和第20h，相差12 h，与未同步化的G1期时长(13.2h)相似。并且，各曲线在20 h处，均出现拐点，推测含羞草素基本不影响QGY-7703细胞周期总时长。

图2　含羞草素阻断后细胞周期分布

2.2胸苷作用后细胞同步化结果

胸苷是DNA的特异前体，氚标记胸苷渗入法是目前常用的细胞增殖检测方法。故此，本研究采用胸苷阻断后QGY-7703细胞各时相的变化来对比研究含羞草素的作用效果。

胸苷处理后(图3)，在前8h内G1期细胞逐渐减少，S期细胞逐渐增多，第8 h 细胞G1期达到最小值29.0%，S期达到最大值75.7%；随后G2/M期细胞逐渐增加，第10 h细胞G2/M期达到最大值为41.9%。此外，细胞G1期的两个峰值分别为2 h的52.2%和22h的87.2%，两峰值间隔20 h，表明实验条件下该细胞周期约为20 h。G2/M期曲线8～12 h出现峰，推测G2/M期时长4 h。S期曲线2～10 h出现峰，推测S期时长8 h。与按空白细胞推测的各期时间长度不同(图1a)，可能是细胞种植密度过大，接触抑制造成G1期延长。

图3　胸腺嘧啶脱氧核苷阻断细胞周期分布

含羞草素与胸苷都是通过调控细胞G1/S时点将细胞阻滞于G1期末，但由图3、图2中的 G1期曲线可发现：胸苷组在第2 h开始减少(图3, G1期2 h处)；而含羞草素处理的在第8 h开始减少(图2，G1期8 h处)，相较于胸苷组延后6 h。同样，对比两种药物处理组的S期曲线，可发现：胸苷组在第8 h开始减少(图3，S期8 h处)；而含羞草素处理的在第20 h开始减少(图2，G1期20 h处)，相较于胸苷组延后12 h。则含羞草素使QGY-7703细胞S期延后6 h。Park 等[16]发现含羞草素可使人宫颈癌Hela细胞株的S早期延后4 h。故此推测，本实验条件下QGY-7703细胞对含羞草素的作用敏感，用药后细胞进入正常周期的时间延后6 h，且S早期也延后6 h。

3讨论

肿瘤的发生发展本质上是细胞周期的失调。大部分抗肿瘤药物具有细胞周期特异性。同步化是研究细胞周期调控与药物特异性作用最重要的方法。

细胞分裂是细胞最基本的生理活动。细胞周期的运行遵循着严格的时相次序。体外培养细胞根据细胞来源不同选用不同阻断方法是细胞停止在细胞周期的某一时相。目前报道的主要有血清饥饿、药物抑制、低温、照射、机械振动收集分裂细胞等[17]。其中，药物阻断法是体外培养细胞人工同步化最常用的方法。该阻断法要求对细胞周期的阻断是可逆的，即去除药物加入培养基后细胞仍可正常生长。

目前应用最多的合成抑制剂是胸苷[16-17]。白瑞霞等[18]通过胸苷阻断人肝癌细胞株HepG2获得了同步率60%以上的 G1期和G2期。胸苷阻断法的优点是细胞同步化效率高，且适用于任何体外培养的细胞体系，缺点是容易造成细胞的不均等生长。含羞草素与胸腺嘧啶具有高度相似性化学结构，可竞争性地与腺嘌呤结合，将细胞同步于G1晚期，并且研究表明含羞草素对多种肿瘤细胞有抑制作用，可作为放射增敏剂增加对肿瘤的疗效[19-22]。本实验条件下，含羞草素不仅能同步肝癌细胞QGY-7703，而且获得的高G1期同步率(80%以上)能够持续10h，这将便于应用于耗时较长的生物物理方面的研究。

4结论

a)QGY-7703细胞在阻断结束后第0～10h内G1期的同步率均维持在80%以上，第10h进入S期，第20h进入G2/M期。

b)可实现的G1、S期最高同步率分别为94.6%和86.0%。且同步率稳定可靠。

c)含羞草素能造成QGY-7703细胞G1期阻滞，并可使S期延后6 h。

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(责任编辑： 许惠儿)

Cyecle Synchronization of Human Hepatoma Cell QGY-7703 Induced by L-mimosine

ZHAOXueqin1,RENLei2,WANGDajin1,ZHANGYongming1,TAOSijie1

(1. College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. College of Materials, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Abstract：Cancer is one of diseases which severely threaten human health. In essence, tumorigenesis and tumor progression result from a disorder of unlimited periodic growth, proliferation and differentiation of cells. Cell synchronization is the foundation of researches on tumorigenesis, tumor progression and treatment. Here, we investigated the effect of L-mimosine blocking on cycle synchronization by taking human. hepatoma cell QGY-7703. Furthermore, compared with thymidine blocking, the effect of L-mimosine blocking removal on cell cycle of QGY-7703 cells was investigated. The results show that QGY-7703 cells enter Sphase at the 10thhour and enter G2/M phase at the 20thhour after release from the L-mimosine. The highest synchronization rate is 94.6% in G1 phase and 86.0% in S phase cells. In conclusion, QGY-7703 cell can be successfully synchronized in G1 phase and S phase by the L-mimosine treatment.

Key words：L-mimosine; human hepatoma cell; cell cycle; synchronization

DOI:10.3969/j.issn.1673-3851.2016.07.024

收稿日期：2015-09-07

基金项目：国家自然科学基金项目(31400797)；浙江省自然科学基金项目(LQ14C100001)；浙江省省科技厅分析测试项目(2015C37031)

作者简介：赵雪芹(1983-)，女，河南平顶山人，博士，主要从事肿瘤治疗方面的研究。

中图分类号：TS195.644

文献标志码：A

文章编号：1673- 3851 (2016) 04- 0620- 05 引用页码： 070701