HPLC法测定浙江慈溪水稻田栽培的西红花中西红花苷Ⅰ、Ⅱ含量的研究

戴智慧，黄士文,2，倪 穗*，胡 伟

(1.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211；2.慈溪市横河镇农业办公室，浙江 慈溪 315318 ；3.慈溪市横河镇童岙茶场，浙江 慈溪 315318)



HPLC法测定浙江慈溪水稻田栽培的西红花中西红花苷Ⅰ、Ⅱ含量的研究

戴智慧1，黄士文1,2，倪 穗1*，胡 伟3

(1.宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211；2.慈溪市横河镇农业办公室，浙江 慈溪 315318 ；3.慈溪市横河镇童岙茶场，浙江 慈溪 315318)

摘要为了检测栽培于浙江慈溪水稻田中的西红花所含的西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量，采用高效液相色谱法，色谱条件为Intertsil ODS-SP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(60∶40)，检测波长440 nm，流速1.0 mL/min，进样量为20 μL，柱温为室温。结果表明：西红花花柱中西红花苷I的平均含量为8.85%，西红花苷Ⅱ的平均含量为3.72%；雄蕊中西红花苷I的平均含量为0.094%，西红花苷Ⅱ的平均含量为0.005%；而花瓣中西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量极少，未能检出。因此，栽培于浙江慈溪水稻田中的西红花花柱中西红花苷I和西红花苷Ⅱ两者含量之和为12.57%，符合2010版《中国药典》的质量标准，可以作为药用。

关键词西红花；西红花苷I；西红花苷Ⅱ；高效液相色谱法；慈溪

西红花(CrocussativusL.)又名为番红花、藏红花，为鸢尾科(Iridaceae)番红花属(Crocus)多年生草本植物[1]。其花柱及柱头可供药用[1]，有活血化瘀、解郁安神、凉血解毒的功效，可用于经闭症瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂等症[2]。此外还有抗精神失常、治疗经前期综合征、治疗神经退行性疾病、治疗脑血管疾病、改善学习记忆障碍、治疗心血管疾病等多种作用[3]。

西红花中含有多种有效的化学成分[3-4]，在这些化学成分中，主要有效成分为西红花总苷类化合物[5]，西红花总苷为混合物,其中西红花苷Ⅰ为含量较高的主成分[6]。西红花苷作为西红花的主要有效成分，在治疗肿瘤、心血管疾病、急性炎症、肝肾疾病等多种疾病的治疗中发挥着重要的作用[6]。目前关于西红花苷类成分含量的测定主要有分光光度法[7-8]、薄层扫描法[9]、高效液相色谱法[5,10-11]、荧光法[12]及LC/MS法[13]。

本研究以浙江慈溪水稻田栽培的西红花为实验材料，采用高效液相色谱法同时测定其花朵不同部位的西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量，研究结果为浙江慈溪水稻田栽培西红花提供理论依据。

1仪器与试剂

1.1仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)：包括SPD-20A检测器，LC-20AT泵；优普超纯水系统(成都超纯科技有限公司)；SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2试剂与材料

标准品：西红花苷Ⅰ (crocin I ,HPLC≥98%)、西红花苷Ⅱ (crocin Ⅱ，HPLC≥98%)，上海源叶生物科技有限公司

甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯，水为纯水。

分析所用的西红花材料于2014年12月采自浙江省慈溪市横河镇西红花栽培基地。将新鲜采集的西红花的花瓣、雄蕊、柱头分别于60 ℃条件下烘干，在4 ℃条件下避光保存备用。

2方法与结果

2.1色谱条件

Inertsil ODS-SP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(60∶40)；检测波长440 nm；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温：室温。

2.2对照品溶液的配制

精密称取对照品西红花苷I和西红花苷Ⅱ各10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶解并稀释至刻度，分别制成0.2 mg/mL的西红花苷I和西红花苷Ⅱ的对照品溶液，置4 ℃ 冰箱避光保存。

2.3供试品溶液的制备

取适量的干燥的西红花花瓣、雄蕊、柱头于研钵中研成细粉，精确称取各个样品粉末10 mg，每个样品称取3份,至50 mL棕色容量瓶中,加入50% 乙醇溶液40 mL，室温避光条件下超声(300 W， 40 kHz)处理30 min，用50%的乙醇定容至刻度，摇匀。溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤至棕色样品瓶中，置4 ℃冰箱避光保存备存。

2.4标准曲线及线性关系的考察

取上述西红花苷I与西红花苷Ⅱ对照品溶液，分别移取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，按上述色谱条件测定峰面积。以西红花苷I和西红花苷Ⅱ对照品浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制得标准曲线见图1。

计算得西红花苷I和西红花苷Ⅱ线性范围均为4.0～64μg/mL，回归方程及相关系数分别为Y=141 710.68X+288 850.46 (r=0.999 6)，Y=161 926.93X+364 797.33 (r=0.999 8)。结果表明，西红花苷I和西红花苷Ⅱ峰面积与其浓度的线性关系良好。

图1　西红花苷I和西红花苷Ⅱ标准曲线图

2.5精密度试验

精密吸取制备的花柱的供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样5次，结果见表1。由表1知，西红花苷I的色谱峰面积RSD为1.87% (n=5)，西红花苷Ⅱ的色谱峰面积RSD为0.81% (n=5)，结果表明仪器精密度良好。

表1　精密度试验结果

2.6重复性试验

取西红花花柱细粉5份，各10 mg精密称定,按照上述供试品溶液的制备方法，平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量并计算其RSD值，结果见表2。由表2知西红花苷I的平均含量为8.56%，RSD为1.79% (n=5)；西红花苷Ⅱ的平均含量为3.64%，RSD为1.12% (n=5)。其RSD值均小于2%,表明试验重复性良好。

表2　重复性试验结果

2.7稳定性试验

吸取同一供试样品溶液，置于4 ℃避光保存，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算RSD值，结果见表3。由表3可知西红花苷I和西红花苷Ⅱ平均峰面积分别为2 706 541、1613795，RSD值分别为1.56%、1.87% (n=5)。表明供试品溶液在4 ℃避光保存在24 h内稳定。

表3　稳定性试验结果

2.8加样回收率试验

精密称取已知含量的花柱5份(西红花苷I含量为8.85%，西红花苷Ⅱ含量为3.72%)各5 mg，加入浓度均为0.2 mg/mL的西红花苷I和西红花苷Ⅱ对照品溶液各3 mL,按上述供试品溶液的制备方法，配制成供试品溶液，按照上述色谱条件进样，分别计算回收率，结果见表4。由表4知西红花苷I的平均回收率为99.01%，RSD为1.77% (n=5)；西红花苷Ⅱ的平均回收率为99.65%(n=5)，RSD为0.42%。

表4　加样回收率试验结果

2.9西红花苷I和西红花苷Ⅱ含量的测定

分别吸取对照品溶液以及3个不同部位的供试品溶液，按照上述色谱条件进样，记录峰面积并计算西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量，连续测定3个批次，取平均值，实验结果见表5。对照品及供试品色谱图见图2。

1.西红花苷Ⅰ；2.西红花苷Ⅱ

由表5可得，花柱中西红花苷I的平均含量为8.85%，西红花苷Ⅱ的平均含量为3.72%；雄蕊中西红花苷I的平均含量为0.094%，西红花苷Ⅱ的平均含量为0.005%；而花瓣中由于西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量极少，在这次实验中未能测得其含量。

表5　西红花不同部位西红花苷I和西红花苷Ⅱ含量测定结果

注：“—”表示未检测出。

3分析与讨论

3.1高效液相色谱法可有效检测西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量

西红花苷类成分极性大且性质很不稳定，会在一定程度上影响其含量的测定结果[5],而高效液相色谱法操作简单、灵敏度高且测得结果稳定，被广泛的应用于西红花苷I和西红花苷Ⅱ含量的测定。本实验开始参照2010版《中国药典》的色谱条件，以甲醇-水(45∶55)为流动相，但出峰时间较晚并且峰形不理想。后经调整以甲醇-水(60∶40)为流动相，出峰时间提前，保留时间缩短(2.5～5min)，并且达到了分离的效果。

3.2浙江慈溪水稻田中的西红花可以作为药用

本实验同时有效地测定出西红花的花柱及雄蕊中的西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量。其中西红花花柱中西红花苷的含量最高，西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量分别为8.85%±0.45%和3.72%±0.11%。西红花苷I和西红花苷Ⅱ两者含量之和为12.57%，这符合2010版《中国药典》规定的西红花苷I和西红花苷Ⅱ两者含量之和不低于10.0%[2]。因此，慈溪水稻田栽培的西红花花柱可以用于药用。而相比于何常明等[5]测得的西红花苷I和西红花苷Ⅱ的含量(含量分别为17.3%和9.8%)相对较少，其原因可能是产地的不同。另外，由于西红花苷的含量易受到光照、采收时间和干燥方法的影响[14]，从慈溪采得的西红花未能及时干燥并避光保存可能是造成其西红花苷含量较低的主要原因。

雄蕊中含有少量的西红花苷I(平均含量为0.094%)和西红花苷Ⅱ(平均含量为0.005%)，因此，雄蕊可以用于茶饮，有日常保健之功效。花瓣中几乎不含西红花苷成分，并且所取的花瓣样品含量较少，未能测出西红花苷I和西红花苷Ⅱ。

参考文献：

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[14]上海华宇药业有限公司．西红花种植方法:200410025470.X[P].2004-06-25．

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.006

收稿日期：2015-08-11

基金项目:慈溪市科技局民生类科技计划项目(CN2012006)；慈溪市农业局科技项目(201104)；宁波市农科教项目(2012NK02)—珍贵中药材西红花引种与栽培技术研究。

作者简介:戴智慧(1989—),女,研究生,主要研究方向:植物生物学。E-mail:lh.huihui@163.com *通讯作者:倪穗(1965—),女,教授,主要研究方向:植物生物学。E-mail:nisui@nbu.edu.cn

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1006-9690(2016)-02-0014-05

Content Determination of Crocin I and Crocin Ⅱ inCrocussativusL.Cultivated from Rice Paddy in Cixi, Zhejiang Province by HPLC

Dai Zhihui1, Huang Shiwen1,2, Ni Sui1,Hu Wei3

(1.School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211, China;2.Cixi Agricultural Office of Henghe, Cixi 315318,China;3.Tong’ao Tea Plantation of Henghe, Cixi 315318,China)

AbstractTo determine the content of crocin I and crocin Ⅱ in Crocus sativus L. cultivated from rice paddy in Cixi, Zhejiang Province. In this paper, the active ingredients of different parts of saffronwere detected by high performance liquid chromatography (HPLC).And Inertsil ODS-SP C18chromatographic column( 150 mm×4.6 mm，5 μm) was used. The mobile phase was methanol and water (60∶40). The detection wavelength was 440 nm，the flow rate was 1.0 mL/min,the injection volume was 20 μL and the column temperature was room temperature. The results showed that the average content of crocin I was 8.85% and the average content of crocin Ⅱ was 3.72% in style of saffron. The average content of crocin I was 0.094% and the average content of crocin Ⅱ was 0.005% in stamen of saffron. While the content of crocin I and crocin Ⅱ in petal of saffron was few, it did not be detected. The both content of crocin I and crocin Ⅱ was 12.57% in style of saffron,which met the quality of the 2010 edition of China Pharmacopoeia standard. So the saffron cultivated from rice paddy in Cixi, Zhejiang province can be used as medicine.

Key wordsCrocus sativus L. ; Crocin I ;Crocin Ⅱ ;HPLC;Cixi