大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析

肖　业，王婷婷，向双林

(湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙　410081)



大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析

肖业，王婷婷，向双林

(湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙410081)

摘要采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库，从中筛选出与RNase Ⅲ有相互作用的蛋白，为研究RNase Ⅲ蛋白在原核生物中的作用奠定基础.用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA，在E.coli poly(A) Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾，分离纯化mRNA，利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA.经pfx酶补平双链末端，在两端加上EcoRⅠ接头，XhoⅠ酶切消化产生粘性末端.用CHROMA SPIN-400 column分级分离纯化cDNA片段，与pTRG XR载体连接后，电击转入XL1-BLUE MRF′菌电转感受态中.得到原始文库，经计算文库的容量达到3×106个克隆.用PCR方法测得文库的重组率为100%，插入片段的平均长度基本位于300 bp以上，测定放大文库的滴度为:3.15×1010pfu/mL.说明构建的大肠杆菌cDNA 文库质量比较高，适合用于筛选目的基因克隆.

关键词大肠杆菌；细菌双杂交；cDNA文库

RNase Ⅲ是一种双链特异性的核酸内切酶，在细菌、酵母和人类的rRNA成熟过程中起加工rRNA前体的作用，在一些细菌中它也参与mRNA和小片段核酸RNA的加工、RNA干扰或rRNA的成熟过程[1].在真核生物的RNA干扰过程中，RNase Ⅲ起重要作用，主要是Drosha和Dicer两种RNase Ⅲ参与干扰小RNA的剪切成熟过程[2].Yang等发现大肠杆菌的RNase Ⅲ酶能将双链的RNA剪切成endoribonuclease-prepared siRNA(esiRNA)，从而介导有效的RNA干扰[3].为了研究RNase Ⅲ酶在原核生物中的作用，本实验室构建大肠杆菌的cDNA文库，采用细菌双杂交的方式从中钓取出与RNase Ⅲ有相互作用的蛋白.通过分析钓取到的蛋白，研究RNase Ⅲ蛋白在原核生物中的作用，探究细菌内是否存在类似真核生物的RNA干扰方式.

1材料与方法

1.1材料

BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit购自Stratagene公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIAGEN公司，PolyATtract mRNA Isolation system IV购自Promega公司，pBT诱饵质粒和pTRG靶蛋白质粒购自Stratagene公司，pGEX-4T-2和pQE-N2质粒为湖南师范大学基因功能与调控教育部重点实验室保存，限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，CHROMA SPIN-400 column柱子购自Clontech公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，adenine HCl和3-amino-1,2,4-triazole购自Sigma公司，His Dropout Supplement和Bacto agar购自BD/Clontech公司.

1.2方法

1.2.1大肠杆菌总RNA的提取37 ℃培养细菌至OD600达到0.5 ℃左右， 收集3 mL菌体，加入200 μL的TE buffer:10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0，含10 g/L的溶菌酶，室温处理5 min. 5 min后加入1 mL Trizol试剂提取总RNA[4]，将RNA保存在-80 ℃.

1.2.2mRNA加poly(A)尾并纯化用E.colipoly(A) Polymerase加尾酶，给细菌总RNA中的mRNA特异性地加上poly(A)的尾，方法参照NEB公司E.colipoly(A) Polymerase说明书.按Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV试剂盒说明书，分离纯化mRNA，再用12 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.

1.2.3mRNA加尾验证取mRNA 5 μg在逆转录酶的作用下，以oligo(dT)做为引物，反转录合成cDNA第一条链.cDNA第一条链反转录后用细菌的GAPDH引物做PCR，验证mRNA加尾和反转录是否成功，引物序列见表1所示.

表1　引物的名称和序列

1.2.4cDNA双链的合成及纯化参照Stratagene公司的BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit中cDNA双链合成步骤合成cDNA双链，取5 μg mRNA 为模板，以含XhoⅠ酶切位点的Oligo(dT)作为引物，在AccuScript RT反转录酶作用下42 ℃孵育1 h，合成cDNA第一条链.在第一条链混合物中，加入RNase H，DNA polymerase I，second-strand dNTP mixture(其中dCTP甲基化)，16 ℃孵育2.5 h合成cDNA第二条链，用pfx酶补平双链的末端，在T4连接酶的作用下，两端加上EcoRⅠ接头，T4 polynucleotide kinase使其磷酸化后，再用XhoⅠ酶切消化产生cDNA 粘性末端.采用clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱子分级分离纯化cDNA双链片段，主要除掉300 bp以下的片段.

1.2.5高效率电转感受态的制备高效率电转感受态的制备，参照韦晓明等人的实验方法[5].制备好的电转感受态须马上使用.

1.2.6cDNA与表达载体重组及转化寄主菌取90 ng cDNA片段与90 ng pTRG载体，用T4 DNA连接酶，4 ℃连接过夜.加入3倍体积的酒精和0.1倍体积3 mol/L的醋酸钠沉淀连接产物，将沉淀重悬浮在一定体积的水中，得到纯化和浓缩后的连接产物，测定浓度.在4个0.2 cm的电击杯中，将200 ng连接产物转入XL1-BLUE MRF′菌中，得到原始cDNA文库，取一定体积的菌液按梯度稀释后涂在四环素平板上，30 ℃培养，统计克隆数计算文库的容量.

1.2.7cDNA文库的重组率和滴度测定在上一步四环素平板上随机挑取20个克隆，用表2的引物做菌落PCR，条件如下：94 ℃变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,30个循环后再72 ℃延伸10 min.PCR产物做DNA琼脂糖凝胶电泳，判断文库插入片段的大小并计算重组率；收刮所有四环素平板上的克隆，重悬浮于一定体积20%的甘油中，即放大文库.取一定体积的菌液按梯度稀释后，涂布在四环素平板上，30 ℃培养，统计克隆数计算放大文库的滴度.

表2　引物的名称与序列

2结果

2.1大肠杆菌总RNA的提取

按标准的Trizol法提取细菌RNA，整个过程注意防止RNase酶污染，分别取1 μg RNA加在1，2号胶孔中，做DNA琼脂糖电泳，结果如图1，总RNA电泳后可见清晰明显的3个条带，条带干净无拖尾现象且23 S rRNA亮度差不多为16 S rRNA亮度的2倍，OD260/OD280≈2.0, OD260/OD230≈2.0, 这说明总RNA 基本上没有杂蛋白质、酚和硫氰酸胍污染，提取的RNA质量非常高.

2.2mRNA的加poly(A)尾及纯化

给240 μg总RNA中的mRNA做特异的加poly(A)尾处理.加尾后的mRNA纯化后再溶解在30 μL DEPC处理过的水中，测浓度为326.1 mg/L，取0.5 μg做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果如图2，mRNA 呈弥散状分布,前后缘界限明显,一方面说明分离的mRNA 没有降解,另一方面也说明总RNA 的完整性比较好, 基本上没有降解.

图1　大肠杆菌总RNA的提取　　　　 　　　图2　mRNA琼脂糖凝胶电泳　Fig.1　Extracting total RNA from Escherichia coli　　　　Fig.2　Agarose gel electrophoreisis of mRNA

2.3cDNA双链的合成及 cDNA第一条链反转录验证

mRNA加尾后，在反转录酶作用下反转录合成cDNA第一条链，再用细菌的GAPDH引物做PCR，取2 μL做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果见图3，PCR产物大小基本吻合且条带单一(设计GAPDH引物预期PCR产物大小为500 bp)，说明mRNA是成功加上poly(A)尾；cDNA第一条链反转录也是成功的. cDNA第一链和第二条链合成后，分别取5 μL做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果如图4，cDNA呈弥散状分布，且500 bp左右条带较亮，说明cDNA大小呈不均一分布且片段大小大部分在300 bp以上，而在100 bp以下的部分为短片段的cDNA和EcoRⅠ adapters.

图3　细菌GAPDH内参基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳　　　　　　　图4　cDNA第一链和cDNA双链琼脂糖凝胶电泳　　Fig.3　Agarose gel electrophoreisis PCR production of GAPDH　　　　　　　　Fig.4　Agarose gel electrophoreisis of first-strand cDNA and double-stranded cDNA

2.4cDNA双链的纯化

用Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱分级分离纯化合成的cDNA片段，结果如图5，从图来看从6号开始洗脱出cDNA，6～9号管的cDNA片段大小基本在300 bp以上，而10～14号管的cDNA片段大小基本在300 bp以下，须丢弃，因为这些小片段的cDNA 会优先与载体连接, 所构建的cDNA 文库中均是一些小片段的克隆, 造成cDNA 文库完整性非常差.收集6～9号管的cDNA溶液，经异丙醇和醋酸钠沉淀后，重新溶解在20 μL无菌水中，测质量浓度为84 mg/L.

图5　SPIN-400 column柱分级分离纯化cDNA片段Fig.5　cDNA size fractionated by CHROMA SPIN-400 column

2.5文库的构建和质量分析

将原始文库的菌液涂在52个150 mm四环素平板上，计算得到的克隆数达到3×106cfu，即文库容量的大小.从四环素平板上随机挑取20个cfu做菌落PCR，PCR产物做DNA琼脂糖凝胶电泳，1～20号为随机挑取的克隆，结果如图6，从结果来看20个克隆中无空载体，片段大小呈不均一分布且大小基本位于300 bp以上，说明文库质量较高.将52个150 mm平板上的菌落全部刮取下来，计算放大文库的滴度为3.15×1010pfu/mL.

图6　文库插入片段检测Fig.6　The examination results of the insert fragments in the library

3讨论

3.1改善提取高质量细菌RNA的方法

RNA在提取过程中极容易被降解，细菌的RNA 具有含量少、半衰期短、容易降解等特点，所以与动、植物等真核生物相比较，更难提取出高质量的RNA.目前最常使用的RNA 提取方法当推1987 年Chomczynski 等提出的“硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”[6], 其优点是收获的非降解RNA产量大、纯度高, 不需超速离心或多步酚氯仿抽提[7].但需要长时间在氯化铯柱中超离心且毒性强，费用高.2006发表在Nature上的一篇文章，研究者们开发出Trizol试剂，能很方便简单地提取各种样本的总RNA[4].目前提取细菌总RNA方法还有：SDS-Phenol 法、CTAB 法、热硼酸法及改良热硼酸法等[8].本实验发现如果直接用Trizol提细菌总RNA，提出来的RNA质量比较差，可能因为Trizol试剂破细菌细胞壁的能力较差.而用含溶菌酶浓度为10 g/L的TE Buffer预处理除细胞壁后，发现能够提出高质量的RNA.除此之外，收集过夜菌和对数期的菌液提RNA，发现在对数期的菌液能提出更高质量的RNA[9].分别取1.5,3.0,4.5 mL对数期菌液提RNA，发现用3.0 mL菌液能提出质量更好的总RNA.

3.2制备高效率感受态

要构建一个高质量高代表性的文库，需要高效率的感受态.感受态可分为化学感受态和电转感受态，化学转化的方法很多, 如Hanahan法、氯化钙法及Inoue法[10].Hanahan法和Inoue法做得仔细的话，其转化效率可以达到108/μg DNA，但由于其操作复杂, 并且试验结果重复性不理想[5].建库优先考虑电击转化，其转化效率至少可以达到8×108～109/μg DNA.文献报道电场强度和电击脉冲时间是影响电转化效率的两个主要因素[11].1988年William等人研究发现在0.2 cm电击杯中采用2.5 kV场强、200 Ω电阻和25 μF电容的条件能达到最高的转化效率：109～1010/μg DNA，并且感受态浓度越高，电击后立马加入SOC培养基的时间越短，其转化效率也越高[12].OD600值最好界于0.35～0.4之间，一定不能超过0.4.一般感受态做好后都是直接放于-80℃冻存或用液氮速冻，作者发现这会使感受态的转化效率下降约一个数量级.

3.3cDNA文库的构建及评价

用Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV试剂盒富集mRNA时，用0.1×SSC漂洗颗粒时mRNA的得率很低，后来发现采用0.2×SSC漂洗能大幅提高mRNA洗脱得率.cDNA片段的纯化普遍采用的是Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱[13]，不过其纯化步骤比较繁琐，采用Promega公司的Sephacryl S-400 Resin也可以达到相同的效果，而且只需过柱一次，操作简单快捷.

在构建的cDNA文库中，为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，一个cDNA文库至少要包含多少个克隆，可由Clack-Carbon公式计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n) (N为cDNA文库中包含的克隆数；p为要求的概率,通常要求大于99%；1/n为每一种低丰度mRNA占总mRNA的比例).为使某低丰度mRNA概率大于99%，文库的重组子数不应低于1.7×105个[14]，本实验构建的大肠杆菌cDNA文库的容量达到3×106个克隆，足以达到所需标准.而且随机挑取的20个克隆做菌落PCR，结果重组率达到100%，放大文库的滴度为:3.15×1010pfu/mL，说明作者成功构建了一个完好的cDNA文库，可用于后续筛选目的基因、大规模测序等研究.

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(编辑WJ)

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.04.005

收稿日期：2015-10-08

基金项目：国家973计划资助项目(2010CB529900)；长沙市科技局资助项目(K1205221-31)

*通讯作者,E-mail：xshlin@hunnu.edu.cn

中图分类号Q78

文献标识码A

文章编号1000-2537(2016)04-0029-05

Construction of a cDNA Library ofEscherichiaColiand Its Quality Analysis

XIAOYe,WANGTing-ting,XIANGShuang-lin*

(College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

AbstractTo investigate the role of RNase Ⅲ in prokaryote, a cDNA library of Escherichia coli was constructed using the cDNA library construction kit purchased from Stratagene, which could be further used for identifying RNase Ⅲ interacting-proteins. In this study, the cDNA library of E.coli was constructed using the following method: the total RNA of E.coli was extracted using Trizol kit, and the poly(A) tail was specifically added to mRNA with E.coli poly(A) Polymerase. After that, mRNA was separated, purified, and reverse-transcripted into double-strand DNA. The ds-cDNA termini was blunted with pfu DNA polymerase. The blunted cDNAs were added to EcoRⅠ adaptors and then digested by XhoⅠ. The cDNA size was fractionated by CHROMA SPIN-400 column. These purified fragments were ligased into the pTRG XR vector and transformed into XL1-BLUE MRF′ competent cells, which generated the oriental unamplified cDNA library. The unamplified library contained about 3×106 recombinants. The PCR results showed that the percentage of positive recombinant clones was 100%. The length of the inserted cDNA fragment was over 300 bp.The titer of the amplified library was 3.15×1010pfu/mL.The quality of the constructed E.coli library was excellent and helpful to screen new genes in the future.

Key wordsEscherichia coli; Bacteria two-hybrid ; cDNA library