1例HDV抗体 IgM阳性HBV S抗原阴性的肝炎患者分子诊断分析

卢学新　伊瑶　苏秋东　毕胜利



1例HDV抗体 IgM阳性HBV S抗原阴性的肝炎患者分子诊断分析

卢学新伊瑶苏秋东毕胜利

102206 北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

【摘要】目的为了进一步对临床中可能出现HDV抗体IgM阳性，常规HBV 五项检测阴性的特殊患者进行诊断，从而对HDV的感染进行准确的判定。方法设计HBV和HDV的特异引物，通过提取血清中病毒的核酸，扩增出病毒的基因组序列，使用BLAST在Genebank中进行比对。结果本实验在这例血清中扩增到了HDV和HBV的基因序列，通过BLAST后发现扩增序列与HBV和HDV基因序列存在较高的一致性。结论在临床诊断中，HDV感染者会出现血清中HDV抗体IgM阳性HBV S抗原阴性的特殊情况，应当引起临床的重视。

【主题词】HDV；共感染；丁肝抗体；分子诊断

丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷性病毒，必须在乙肝病毒存在的条件下才能进行传播[1]。据估算，丁肝病毒感染者的数量约占乙型肝炎患者的5%，全球约有1700万人发病[2]，在我国的流行病学调查中，丁肝患者在乙肝阳性的人群中的流行率约为2%～5%[3]。丁型病毒性肝炎通常与更严重的肝损伤和重度慢性肝炎相关，如果出现误诊会对患者的生命带来严重的影响[4]。现在临床上一般采用血清学方法对患者进行检测，当血清中出现丁肝病毒特异性的抗体时，判定感染了丁肝病毒[5-9]。但其中少数患者乙肝常规五项检测结果为阴性，这与丁肝病毒的生物学特性相悖，给临床上对丁肝的诊断和治疗带来了困难。

本实验收集了1例来自浙江某医院的丁肝IgM阳性但乙肝S抗原阴性的血清标本，采用核酸检测的方法，对标本进行进一步检测。提取血清总核酸后，通过对丁肝RNA进行逆转录后，设计巣式PCR引物，扩增出丁肝基因组核酸的序列。同时对乙肝病毒进行Nest-PCR，扩增乙肝病毒的保守区。实验证明临床中存在丁肝病毒抗体IgM阳性但乙肝五项检测均为阴性的特殊患者。

1材料与方法

1.1材料来自浙江省某医院的血清一份，对血清进行了丁肝病毒IgG抗体，丁肝病毒 IgM 抗体，常规乙肝五项(HbsAg，抗-HBs，HbeAg，抗-HBe抗-HBc-IgG)检测复核，结果分别为HDV IgM 阳性,HDV IgG阴性，常规乙肝五项检查均为阴性。丁肝IgG和IgM检测试剂盒购买自北京贝尔生物工程有限公司，乙肝五项检测试剂盒购买自北京万泰生物药业股份有限公司，实验中血清RNA/DNA提取试剂盒购买自德国Qiagen公司，胶回收试剂盒购买自六合通公司，引物合成和测序均由六合华大基因公司完成。

1.2血清中病毒核酸的提取血清中病毒DNA和RNA通过QIAamp MinElute Virus Spin Kit试剂盒提取，使用的血清为0.2 ml，最终使用20 μl的DEPC处理的高纯水洗脱。所有操作按照说明书，通过德国Qiagen公司的自动核酸提取仪进行。提取的病毒RNA/DNA储存于-80℃。

1.3丁肝病毒核酸的逆转录和Nest-PCR反转录试剂盒使用的是Thermo fisher公司的Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，丁肝病毒的RT-PCR反应体系1为10 μl，体系1的组成为1 μl的6 bp的random primer，1 μl的dNTP, 8 μl的血清核酸提取产物。体系2 的组成为1 μl的逆转录酶，4 μl 5X的buffer，0.5 μl的Ranse inhibitor 加水至10 μl。反应过程为体系1 先65℃水浴5 min后，立即冰浴3 min，然后加10 μl的体系2，整个RT-PCR的反应体系为20 μl。反应条件为30℃10 min，42℃ 1 h，70℃15 min，4℃，30 min。 反应后液体储存于-20℃。

随后进行丁肝的Nest-PCR，外侧引物为上游引物wf-DM：5′-TTTCAAAGTGACCGAGGGGGGTGAC-3′; 下游引物wr-DM：5′-GGGGGTGTGAACCCCCTCGAAGGTG-3′.内测引物为: 上游nf—Dm: 5′- GCGTTCCATCCTTTCTTACCTGATG-3′；下游nr-Dm：5′- GACGAGAGAAGGGAAAGAAGAATAG-3′. 反应体系为50 μl，PCR的反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min。 30个循环后取1 μl作为模板进行第二轮PCR，反应条件和第一轮相同。反应结束后，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。随后切取目标条带。16℃反应连接至pUC18-T载体。转化至DH5а菌株，挑取单克隆送往公司测序。

1.4乙肝病毒的Nest-PCR乙肝病毒的反应体系为50 μl，反应体系为2 μl的模板，上下引物各1 μl，25 μl的PCR mix，加去离子水补齐至50 μl。第一轮外侧PCR的上游引物为:5′-AGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCG-3′，下游引物为：5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3′。反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min，反应进行30个循环。第二轮内测PCR的上游引物是：5′-CCCGCAAATATACATCGTTTCCATG-3′，下游引物是：5′-ACAGTCTTTGAAGTATGCCTCAAGG-3′，PCR 反应条件同上。35个循环后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。切取目标条带连接至TaKaRa公司的pMD18-T载体。转化E.coliDH5а菌株，挑取单克隆送往公司测序。

1.5序列比对分析将测序结果使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的在线Standard Nucleotide BLAST工具进行比对，比对时的参数选择默认选项，得到结果进行评价。

2结果

2.1丁肝病毒和乙肝病毒的PCR 结果通过对丁肝病毒特异性的巣式PCR后，丁肝病毒保守区扩增片段长度为381 bp，乙肝病毒的特异性序列的扩增是长度为320 bp，与预期大小相符。如图1所示。

2.2测序后进行BLAST比对测序片段经过胶回收纯化后，连接在pUCMD-18T载体上，进行测序。测序后的结果与Genebank数据库进行BLAST比对。

2.3丁肝病毒克隆序列BLAST比对结果对测序得到的381 bp的序列进行BLAST序列进行比对，比对的为Program BLASTN 2.3.1+，全部的381 bp均在数据库中有匹配，与数据库中有多条一致性达到99%的序列，在图2中，显示一致性较高的6条序列。这六条序列全部来自于HDV已有的测序结果，属于HDV基因型Ⅰ型。因此可以推断，从实验样本中PCR获取到的序列是来自于丁肝病毒特异性扩增的序列，也证明了患者体内是存在丁型肝炎病毒。

表1　HDV克隆测序的blast比对结果

2.4乙肝病毒克隆序列Blast比对结果采用和HDV同样的对比条件，经过序列比对后，目的序列与Genebank中存在一致性高达98%的序列，所有一致性较高的序列来自于HBV的分离株，分离株属于基因型B型。由此证明，患者血清中分离到了HBV病毒，患者体内存在乙型肝炎病毒。

表2　HBV克隆测序的blast比对结果

通过Blast比对，扩增的丁肝病毒序列和乙肝病毒序列与Genebank数据库中的序列一致性在99%和98%以上，结果表明此例患者同时感染了乙肝病毒和丁肝病毒。在非肝移植的患者中，HDV的感染和HBV的感染时同时存在的，这是符合HDV生物学特性的，但血清学中会出现HDV IgM阳性而常规HBV 五项检测阴性的结果，在临床诊疗中也是实际存在的，应引起关注。

3讨论

丁型肝炎病毒的病毒颗粒外层是乙肝病毒的表面抗原构成的双层膜结构，在临床采用的血清学检测方法中，由于抗体不能识别被膜包裹的HDV抗原，所以临床中多采用检测血清中针对丁肝病毒抗原的抗体存在与否进行判断是否被丁肝病毒感染[10]。现在已经有了依赖丁型肝炎病毒核酸的检测试剂盒，但由于丁肝病毒是RNA病毒，对血清的处理会导致临床应用中不确定的因素增加，干扰对结果的判定。现在临床多数还是采用血清学方法对丁肝感染进行判定。血清学检测中很多特殊的结果会影响对疾病的诊断，进而影响患者的治疗，本实验解释了一种特殊型结果存在的可能。当前临床诊断中采用的ElISA方法只能检测到ng级别的抗体水平，这可能带来假阴性的结果。不同厂家的试剂存在敏感性和特异性的差异，造成检测结果的不同，也会影响检测的可靠性。

丁型肝炎病毒可以通过共感染或是超感染两种方式感染患者[11]，在超感染者中，患者已经是乙肝病毒的携带者或是处于乙肝病毒的复制期。此时丁肝病毒的复制会导致患者严重的肝损伤，加重病情的发展。由于患者体内预先存在针对乙肝患者的免疫反应，血清中的乙肝表面抗体检测呈阳性反应。但在共感染的群体中，乙肝病毒和丁肝病毒同时感染机体，丁肝病毒在复制的过程中，会抑制乙肝病毒的复制。共感染的患者约90%～95%会恢复，并不能发展为慢性丁型病毒性肝炎，与超感染中仅仅5%～10%的恢复患者形成显著性的对比[12]。这是丁肝病毒本身的生物学特征决定的。丁肝病毒抑制了乙肝病毒的复制，少量的乙肝病毒并没有激发机体针对表面抗原特异的抗体出现，乙肝病毒的复制受到抑制，血清中的S抗原并没有达到ELISA方法检测的限度，这是本实验中血清检测结果出现的可能原因。应该进行更多的检测，通过对大量临床样本的进一步检测，对得到的病毒核酸序列进一步分析，对该病人进一步观察，对实验结果进一步验证。有文献报道可以在这类病人的血清中检测到乙肝核心抗体的IgM为阳性，这可以说明HDV的感染时通过和HBV的共感染产生的。本例患者也应进行核心抗体IgM的检测，可以对患者的感染情况进行更准确的判断。

根据当前对HDV生命周期的研究，一旦机体被HDV感染，虽然没有HDV病毒产物的出现，但是HDV可以在肝细胞内进行复制及产生抗原，这种不成熟的病毒缺少HBV的表面抗原不能排出细胞外。当机体再次被HBV感染时，表面抗原可以帮助HDV形成完整的颗粒，就会引起丁型病毒性肝炎，并且引起的肝损伤会较普通的病毒性肝炎更加严重。现在已有土拨鼠模型证明了这种现象的存在，土拨鼠可表达丁肝抗原，当注射高滴度的WHBV血清时，血中出现了HDV的感染性的完整病毒颗粒。在临床检查中，如果出现HDV IgM阳性而HBV为阴性的患者，必须要对患者给予适当的指导，避免因为再次接触HBV而引起更严重的肝脏疾病。

4参考文献

[1]Negro F, Baldi M, Bonino F, et al. Chronic HDV (hepatitis delta virus) hepatitis. Intrahepatic expression of delta antigen, histologic activity and outcome of liver disease. J Hepatol, 1988，6(1): 8-14. doi：10.1016/S0168-8278(88)80457-4.

[2]Manesis EK, Vourli G, Dalekos G, et al.Prevalence and clinical course of hepatitis delta infection in Greece: a 13-year prospective study. J Hepatol, 2013，59(5): 949-56.doi：10.1016/j.jhep.2013.07.005.

[3]Semenov AV. Prevalence of seronegative hepatitis D among patients with chronic viral hepatitis B. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2012，6(1): 106-109. doi:PMID: 23297644.

[4]Gunsar F.Treatment of delta hepatitis. Expert Rev Anti Infect Ther, 2013,11: 489-98.doi：10.1586/eri.13.35.

[5]Rizzetto M, Hepatitis D Virus: Introduction and Epidemiology. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015，5(7): a021576. doi:10.1101/cshperspect.a021576.

[6]Wranke A, Heidrich B, Ernst S, et al. Anti-HDV IgM as a marker of disease activity in hepatitis delta. PLoS One, 2014,9(7): e101002. doi：10.1371/journal.pone.0101002.

[7]Olivero A, Smedile A. Hepatitis delta virus diagnosis. Semin Liver Dis, 2012，32(3): 220-227. doi：10.1055/s-0032-1323627.

[8]Olal SO, Akere A, Otegbayo JA, et al.Are patients with primary hepatocellular carcinoma infectious of hepatitis B, C and D viruses? Afr J Med Med Sci, 2012, 41 Suppl: 187-191. doi：PMID: 23678655.

[9]Mederacke I, Yurdaydin C, Dalekos GN, et al. Anti-HDV immunoglobulin M testing in hepatitis delta revisited: correlations with disease activity and response to pegylated interferon-alpha2a treatment. Antivir Ther, 2012，17(2): 305-312. doi：10.3851/IMP1926.

[10]Alfaiate D, Deny P, Durantel D. Hepatitis delta virus: From biological and medical aspects to current and investigational therapeutic options. Antiviral Res, 2015，122: 112-29. doi：10.1016/j.antiviral.2015.08.009.

[11]Mansour W,Lemoine M, Neripinto F, et al. Markers of hepatitis delta virus infection can be detected in follicular fluid and semen. J Clin Virol, 2014，61(2): 279-281. doi： 10.1016/j.jcv.2014.06.029.

[12]Yurdaydin C. Idilman R, Therapy of Delta Hepatitis. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015，5(10).doi：10.1101/cshperspect.a021543.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.012

(收稿日期：2016-03-12)

Molecular diagnostic analysis of hepatitis patients with HDV IgM antibody positive and the HBV surface Antigen-negative

LuXuexin，YiYao,SuQiudong,BiShengli

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,ChangbaiRoad155,Beijing102206,China

【Abstract】ObjectiveIn order to further accurate diagnosis of the special serum with HDV IgM antibody positive but conventional HBV five detection negative. Methods designing the specific primers，by extracting the nucleic acid of the virus in the serum , amplifying the virus genome conservative region, and then blast the sequences in Genebak. ResultsIn this study, the HDV and HBV conserved regions were amplified in the serum, after blast, the amplified sequences were found to be consistent with the conserved regions of HBV and HDV. ConclusionIn clinical, HDV infection will appears in the serum of HDV antibody IgM positive but HBV S antigen negative, it should cause more attention in clinic for HDV infected.

【Key words】HDV；co-infection；antibody for HDV；Nucleic Diagnostics

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