日本血吸虫感染对小鼠胰岛素抵抗作用的研究

宫阿娟，李素梅，王 维

日本血吸虫感染对小鼠胰岛素抵抗作用的研究

宫阿娟1，李素梅1，王 维2

目的 探讨日本血吸虫感染对高脂饮食小鼠肝脏组织胰岛素抵抗的作用及其机制研究。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠，随机均等分为正常对照组（NC组）、高脂饮食组（HF组）及高脂饮食复合日本血吸虫感染组（HSJ组）。分别在高脂饲养第6、12周末检测空腹血糖（FBG）、空腹血浆胰岛素（FINS）水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）；ELISA法检测血清干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）水平变化，免疫组化法检测肝脏组织信号转导及转录激活子-4 （STAT4）和信号转导及转录激活子-6（STAT6）蛋白表达情况。结果 感染第6、12周末，HF组HOMA-IR高于NC组（P＜0.01）；感染第12周末，HSJ组HOMA-IR明显低于 HF组（P＜0.05）；感染第6、12周末，HSJ组IL-4高于NC组及HF组（P＜0.05）；感染第12周末，HSJ组STAT6高于HF组（P＜0.05）；感染第6、12周末，HF组STAT4高于NC组（P ＜0.05）。结论 血吸虫慢性感染可改善肥胖小鼠胰岛素抵抗，可能与诱导肝脏组织高度表达STAT6及分泌IL-4有关，为防治糖尿病提供新思路。

日本血吸虫；胰岛素抵抗；STAT4；STAT6

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.004.htm l

慢性炎症是肥胖、2型糖尿病及其并发症共同发病的基础［1］。内脏脂肪组织中的免疫调节性T细胞在炎症早期阶段起着关键作用，其可调节其他免疫细胞进入内脏脂肪组织中，进而调节胰岛素敏感性的变化［2］。辅助性T细胞（T helper cells，Th细胞）在不同的环境刺激下可主要分化为两大极化类型：Th1和Th2。Th1细胞及Th1分泌的细胞因子干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的降低，调节性T细胞、Th2及其分泌因子白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-10、IL-13的增加可改善肥胖个体的胰岛素敏感性［3］。同时信号传导及转录激活因子（singaltransductor and activator of transcription，STAT）调节Th细胞的分化。转录因子STAT4的活化有促炎作用、诱导、促使 IFN-γ的转录和表达的作用，转录因子STAT6有抗炎及诱导IL-4的转录及表达作用［4］。而慢性血吸虫感染可促使组织Th细胞向Th2细胞方向分化，抑制炎症反应，表现出对机体的保护作用。该研究通过建立高脂饮食的肥胖小鼠，观察血吸虫感染急性期和慢性期对小鼠肝组织IL-4、IFN-γ和STAT4、STAT6表达的影响，探讨血吸虫感染急性期和慢性期对肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗影响的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组 3周龄C57BL/6J雄性小鼠36只，清洁级，10.2～15.2 g，由安徽医科大学动物实验中心提供。所有动物经适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（NC组）12只，给予标准饲料；高脂饮食组（HF组）12只，给予高脂饲料（基础饲料的基础上添加15%蔗糖、15%熟猪油、2%胆固醇、0.3%胆盐，安徽医科大学动物实验中心动物房提供）；高脂饮食复合日本血吸虫感染组（HSJ组）12只，由安徽医科大学病原教研室提供的日本血吸虫尾蚴感染小鼠腹部皮肤，同时给予高脂饲料。

1.1.2 标本的收集建模 第6、12周，采用10%的水合氯醛（0.003 5 ml/g）腹腔注射麻醉，眼球摘除法收集血液，断颈后解剖小鼠腹部取其肝脏组织，部分于4%多聚甲醛溶液固定，其余肝组织放冻存管中于-80℃冰箱保存。

1.1.3 主要试剂及仪器 血糖仪（德国罗氏公司）；血浆胰岛素（fasting plasma insulin，FINS）试剂盒（北京北方研究所）；IFN-γ、IL-4检测试剂盒、STAT4及STAT6兔抗小鼠一抗、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司）；二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 检测指标及方法 测定空腹血糖（fasting peripheral blood glucose，FBG）及FINS并计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）。小鼠隔夜禁食不禁水，剪尾，测FBG；眼球摘除法收集的血液，常温下在离心管中3 500 r/min离心10 min，收集血清，放射免疫法检测空腹胰岛素，并计算HOMA-IR。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS （μIU/m l）/22.5［5］；ELISA法测定IL-4、IFN-γ，采用酶标仪450 nm处测定吸光度值；免疫组化法测定肝脏组织STAT4和STAT6的表达，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，3～5μm组织切片，一抗孵育过夜（STAT4、STAT6一抗，抗体浓度均为1∶100），DAB显色。每张切片，在镜下（×400）随机选 5个不同视野，拍照，采用Image-Pro Plus 6软件对图像进行半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料采用±s表示。两组间比较采用独立样本的t检验。

2 结果

2.1 小鼠一般情况 感染第6周末，随机从每组小鼠选取6只，其中HSJ组1只小鼠感染未成功，淘汰出组；在第7周，NC组小鼠死亡1只；第10周，HSJ组小鼠死亡1只。故12周末时，NC组5只小鼠，HF组6只小鼠，HSJ组5只小鼠。

2.2 各组小鼠体重、FBG、FINS、HOM A-IR的水平变化 第6周末：HF组及HSJ组小鼠体重较NC组增加20%，肥胖小鼠模型造模成功；HF组体重（t =5.169，P＜0.01）、HOMA-IR（t=5.963，P＜0.01）及FINS（t=15.421，P＜0.01）较NC组升高；HSJ组体重（t=3.278，P＜0.05）、HOMA-IR（t=5.856，P ＜0.01）及FINS（t=15.421，P＜0.01）较NC组升高；第12周末：HF组体重（t=7.538，P＜0.01）、FINS（t=8.216，P＜0.01）、HOMA-IR（t=5.132，P ＜0.01）均较同期NC组明显升高；HSJ组体重（t= -4.169，P＜0.01）、FINS（t=-4.696，P＜0.01）、FBG（t=-3.486，P＜0.05）、HOMA-IR（t=-2.889，P＜0.05）较同期HF组明显下降。见表1。

2.3 各组小鼠血清IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4 第6周末：HSJ组IL-4（t=8.776，P＜0.01）、IFN-γ（t= 12.009，P＜0.01）较NC组升高；HF组IFN-γ（t= 11.940，P＜0.01）较NC组升高；HSJ组IL-4（t= 6.467，P＜0.01）较HF组升高；第6周末，NC组及HSJ组倾向于Th2方向免疫应答，HF组倾向于Th1方向免疫应答。第12周末：HF组IFN-γ（t= 10.241，P＜0.01）、IL-4（t=5.285，P＜0.05）均较NC组升高；HSJ组IFN-γ（t=13.111，P＜0.01）、IL-4（t=12.788，P＜0.01）均较NC组升高；HSJ组IL-4 （t=6.780，P＜0.01）较HF组升高。见表2。

2.4 各组小鼠肝组织STAT4、STAT6蛋白表达

第6周末：HF组STAT4蛋白表达（t=10.729，P＜0.01）、STAT6蛋白表达（t=11.436，P＜0.01）均高于NC组；HSJ组STAT4蛋白表达（t=7.317，P＜0.01）、STAT6蛋白表达（t=9.933，P＜0.01）均高于NC组；HF组STAT4蛋白表达较HSJ组STAT4蛋白表达升高，差异无统计学意义；HSJ组STAT6蛋白表达较HF组升高，差异无统计学意义。见图1。

第12周末：HF组STAT4（t=4.355，P＜0.05）、STAT6蛋白表达（t=9.296，P＜0.01）较NC组升高；HSJ组STAT4（t=5.292，P＜0.01）、STAT6蛋白表达（t=7.680，P＜0.01）较NC组升高；HF组STAT4蛋白表达较HSJ组STAT4蛋白表达升高，差异无统计学意义；HSJ组STAT6蛋白表达（t= 2.822，P＜0.05）较HF组升高；HSJ组STAT6蛋白表达较第6周末STAT6蛋白表达升高（t=2.700，P ＜0.05）。见表3、图2。

表1 第6、12周末各组小鼠体重、FBG、FINS及　HOMA-IR的比较（n=6±s）

表1 第6、12周末各组小鼠体重、FBG、FINS及　HOMA-IR的比较（n=6±s）

与同期　NC组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同期HF组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与第6周末各组之间比较：△P＜0.05，△△P＜0.01

组别　第6 第12 HOMA-IR NC　20.05±2.31　8.23±1.04　10.20±2.54　2.98±1.11　25.30±2.01△　7.23±1.19　10.87±3.58　3.78±1.29周末体重（g）　FBG（mmol/L）FINS（μIU/ml）HOMA-IR周末体重（g）　FBG（mmol/L）　FINS（μIU/ml）HF　25.98±1.60**9.02±1.65　28.05±1.26**9.55±2.46**　34.29±2.12**△△　9.87±1.68*　44.86±9.48**△△15.86±5.62**HSJ　24.99±2.88*　8.93±1.29　22.35±6.05**7.27±1.41*　27.94±3.07##　7.02±1.09#△　23.78±5.57*##　8.68±2.34*#

表2 3组小鼠IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4动态比较（±s）

表2 3组小鼠IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4动态比较（±s）

与同期　NC组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同期　HF组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与第6周末各组之间比较：△P＜0.05

组别　第6 第12 24　63.06±4.78　0.95±0.24 HF　76.61±3.99**　70.73±4.91*　1.10±0.07　86.76±5.12**△　79.23±5.26**△　1.06±0.13 HSJ　87.05±6.46**#　93.24±6.97*##　0.93±0.20　92.32±4.98**　101.42±5.58**##/IL-4 NC　51.53±3.28　55.31±8.02　0.91±0.16　57.31±4.周末IFN-γ　IL-4　IFN-γ/IL-4周末IFN-γ　IL-4　IFN-γ 0.91±0.17

表3 各组小鼠　STAT4、STAT6动态比较（±s）

表3 各组小鼠　STAT4、STAT6动态比较（±s）

与同期NC组比较：*P＜0.05；与同期　HF组比较：#P＜0.05；与第6周末各组之间比较：△P＜0.05

组别STAT4 第6周末　第12周末STAT6 第6周末　第12周末NC　0.41±0.04　0.40±0.03　0.39±0.03　0.40±0.04 HF　1.09±0.15*　1.28±0.32*　1.15±0.16*　1.17±0.18*HSJ　0.99±0.19*　1.09±0.29*　1.17±0.19*　1.63±0.35*#△

图1 第6周末免疫组化法检测小鼠肝组织STAT4、STAT6蛋白表达 ×400A：阴性对照组；B：NC组；C：HF组；D：HSJ组；1：STAT4蛋白表达；2：STAT6蛋白表达；Ⅰ：HE染色；Ⅱ：DAB染色

图2 第12周末免疫组化法检测小鼠肝组织STAT4、STAT6蛋白表达 ×400A：阴性对照组；B：NC组；C：HF组；D：HSJ组；1：STAT4蛋白表达；2：STAT6蛋白表达；Ⅰ：HE染色；Ⅱ：DAB染色

3 讨论

Th细胞大致可分为两大细胞亚群：促炎症性细胞（Th1和Th17）及抗炎症性细胞（调节性T细胞和Th2细胞）［6］。T细胞在维持机体内环境平衡及避免炎症性疾病发病中起着重要作用。2型糖尿病出现炎症状态主要由于T细胞亚群的失衡造成的，表现为机体内Th1及Th17细胞的数量增加，Th细胞及Th2细胞数量减少，从而促进机体慢性炎症及胰岛素抵抗的发展［7］。2型糖尿病患者体内产生大量的IFN-γ及少量的IL-4，同时显示患者体内的促炎性T细胞是增加的，而抗炎性T细胞是减少的［8］。肥胖伴胰岛素抵抗模型的2型糖尿病鼠体内的T细胞失衡，表现为脂肪组织的Th细胞及Th2细胞与正常鼠比较数量大量减少，同时肥胖鼠脂肪组织中的IFN-γ是升高的，IL-4降低［9］。本研究显示，第6、12周末HF组IFN-γ、HOMA-IR较NC组升高。第6、12周末HF组IFN-γ/IL-4较NC组升高。以上研究表明2型糖尿病肥胖小鼠内高度表达促炎因子且倾向于Th1免疫应答，从而促进胰岛素抵抗的发生发展。

小鼠感染曼氏血吸虫后，其肝脏倾向于Th2免疫应答并分泌大量的Th2细胞因子，从而显著减少由PPARα介导的柠檬酸循环、氧化磷酸化及脂肪酸氧化蛋白的生成［10］。哺乳动物感染蠕虫后，在慢性感染期趋向于Th2免疫轴应答，并通过驱动Th细胞产生IL-10及TGF-β抑制Th1介导的免疫应答［11］。糖尿病小鼠感染日本血吸虫后，其胰岛素抵抗得到改善，其机制可能是通过升高IL-4及降低IFN-γ，调节Th1/Th2免疫轴偏移，使其倾向于Th2免疫轴偏移有关［12］。STAT蛋白的激活调控T细胞的分化，JAK酪氨酸酶通过细胞因子或生长因子的作用使STAT蛋白磷酸化，磷酸化的STAT转入到细胞核内，结合DNA及激活转录二聚体，从而诱导靶基因的转录［13］，从而具有诱导增殖、生长、细胞分化、凋亡、炎症、细胞免疫等作用。IL-12可以通过STAT4途径刺激Th1细胞分泌IFN-γ，IL-4通过STAT6途径诱导Th2细胞的分化［14］。STAT4的活化具有促炎作用，STAT4决定Th0向Th1转化，进而诱导、促使IFN-γ的转录和表达［15］。STAT6的活化有免疫调节、抑制免疫的作用，STAT6决定Th2细胞的极化，诱导Th2细胞因子IL-4的表达［16］。本研究显示第12周末HSJ组HOMA-IR较同期HF组降低。第6、12周末，HSJ组IL-4均较HF组及NC组升高；且第12周末HSJ组STAT6蛋白表达较HF组升高，并且本研究显示在感染的12周末HSJ组的免疫应答倾向于Th2轴。因此本研究与以上文献均表明慢性血吸虫感染期可能与诱导分泌IL-4的表达及促进肝脏组织表达STAT6蛋白有关，进而促进Th2细胞的分化来改善肥胖小鼠肝脏胰岛素抵抗。

综上所述，胰岛素抵抗肥胖小鼠体内Th细胞处于失衡状态，血吸虫感染急性期可能发挥促炎作用，而在血吸虫感染慢性期Th细胞倾向于Th2免疫应答，从而改善机体胰岛素抵抗。STAT4及STAT6蛋白可调控 Th1/Th2的极化。血吸虫感染慢性期可以通过诱导Th2分化、分泌IL-4及促进肝脏组织STAT6蛋白的表达进而改善机体胰岛素抵抗及减轻小鼠体重，为开发改善胰岛素抵抗的药物提供新思路。

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Methods 36 male C57BL/6J mice were randomly assigned into three equal groups：normal control group（NC group），high-fat diet group（HF group）and high-fat diet with Schistosoma japonicum infected group（HSJ group）. Specimen was collected 6 and 12 weeks after high-fat diet，separately.The levels of fasting blood glucose（FBG），fasting plasma insulin resistance index（FINS）and insulin（HOMA-IR）were detected.Interferon-γ（IFN-γ），interleukin-4（IL-4）and singal transductor and activator of transcription-4（STAT4）singal transductor and activator of transcription-6（STAT6）were detected by ELISA and immunohistochemical method.Results The mice from HF group showed higher levels of HOMA-IR than those from NC groups by the end of 6 and 12 weeks after infection（P ＜0.01）；the levels of HOMA-IR in mice from HSJ group were lower than NC group and HF group by the end of 12 weeks（P＜0.05）；the levels of IL-4 in mice from HSJ group were higher than NC group and HSJ group by the end of 6 and 12 weeks after infection（P＜0.05）；the levels of STAT6 in mice from HSJ group were higher than HF group by the end of 12 weeks after infection（P＜0.05）；the levels of STAT4 in mice from HF group were higher than NC group by the end of 6 and 12 weeks after infection.Conclusion Schistosome japonicum chronic infection may improve insulin resistance in obese mice with induced STAT6 protein expressed in liver tissue and secrete IL-4，providing new ideas for the prevention and treatment of diabetes.

Schistosoma japonicum infection in obesemouse insulin resistance

Gong Ajuan1，Li Sumei1，Wang Wei2
（1Deptof Endocrinology，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001；2Dept of Parasitology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate Schistosoma japonicum infection on mice high-fat diet of insulin resistance.

Schistosoma japonicum；insulin resistance；STAT4；STAT6

R 383.2

A

1000-1492（2016）04-0468-05

2015-11-21接收

安徽省卫生厅医学科研基金（编号：13zc017）

1安徽医科大学附属省立医院内分泌科，合肥 230001
2安徽医科大学寄生虫学教研室，合肥 230032

宫阿娟，女，硕士研究生；
李素梅，女，主任医师，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mali：Lisumei0808@126.com