经不同输注途径骨髓间充质干细胞治疗鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效比较

张美华+余卫+王巧瑜+温凌+萧间开+潘洁

【摘要】 目的 比较经腹腔注射与经尾静脉注射骨髓间充质干细胞治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效。方法 选取10只体重约80 g的雄性清洁级SD大鼠用于骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养。另选取体重220～250 g的成年大鼠60只作为研究对象， 用于肝衰竭模型制备以及BMSCs输注治疗。将其中15只大鼠作为空白对照组， 剩下的45只均给予白毒伞粗毒素灌胃制备肝衰竭模型， 将造模成功的大鼠随机均分为3组， 即肝衰竭模型组、经腹腔注射治疗组及经尾静脉注射治疗组。对两治疗组予BMSCs经两种途径输注治疗， 对比各组大鼠7 d生存率及肝功能、凝血功能、炎症因子等指标情况。

结果 与肝衰竭模型组相比， 两治疗组SD大鼠体重减轻明显更少（P<0.05）， 7 d生存率要明显更高[73.3%、80.0% VS 20.0%]（P<0.05）， 两治疗组上述指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后两治疗组大鼠肝功能、凝血功能、炎症因子等指标均较肝衰竭模型组显著改善（P<0.05）， 两治疗组上述指标比较差异无统计学意义（P>0.05）， 空白对照组大鼠肝功能、凝血功能、炎症因子等指标与其他三组比较， 差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 经腹腔注射和经尾静脉注射两种输注途径骨髓间充质干细胞对白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠具有十分明显的治疗作用， 能显著改善大鼠肝功能衰竭， 且效果相当。

【关键词】 骨髓间充质干细胞；白毒伞；急性肝衰竭；疗效；输注途径

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.192

白毒伞（amanita verna）为剧毒蘑菇， 近年来广东地区频频发生因误食白毒伞而中毒死亡的事件。白毒伞鹅膏毒肽主要损害肝脏， 其中毒致急性肝衰竭死亡率>95%， 危害极大。白毒伞中毒致急性肝衰竭（AALF）发病凶猛， 临床症状复杂， 治疗难度较大， 至今仍是医学界的难题之一[1]。目前国内外仍然缺乏对白毒伞中毒致急性肝衰竭的有效治疗手段， 而随着医学界对干细胞研究的逐渐深入， 应用干细胞对急性肝衰竭的治疗已经得到了迅速的发展。本研究以此为背景， 比较经腹腔注射与经尾静脉注射两种不同输注途径骨髓间充质干细胞治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效， 旨在为选择合理的输注途径提供参考， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取10只体重约80 g的雄性清洁级SD大鼠用于骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养。另选取体重220～250 g的SD大鼠60只作为研究对象， 用于模型制备以及BMSCs输注治疗。实验动物由广州医科大学动物中心提供， 实验过程中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。将其中15只大鼠作为空白对照组， 另外45只均给予白毒伞粗毒素灌胃制备肝衰竭模型， 将造模成功的大鼠随机分为肝衰竭模型组、经腹腔注射治疗组及经尾静脉注射治疗组， 各15只。

1. 2 仪器与试剂 主要试剂包括DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（四季清公司）、胰蛋白酶（宝泰克公司）、PBS缓冲液（自制）。主要仪器包括超净工作台、恒温细胞培养箱、荧光倒置显微镜、离心机、水浴箱、低温冰箱等。

1. 3 BMSCs的制备 将所选取用于制备 BMSCs的大鼠断颈处死， 取其股骨， 无菌条件下采集大鼠骨髓液， 采用密度梯度离心法[2]， 反复贴壁分离纯化BMSCs。抗凝骨髓标本置于Percoll分离液梯度离心， 吸取中间单个核细胞（MNC）白膜层， 以1×106/ml的密度接种于培养瓶， 培养体系为含10%FBS的DMEM培养基， 置于37℃、5% CO2的培养箱培养。48 h后换液， 之后每隔3～4 d换液1次， 取出悬浮细胞后， BMSCs将不断纯化。当细胞生长融合达到80%～90%时， 用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化分散的细胞。此时将细胞标记为P1代， 以后每隔3～4 d换液1次， 当细胞生长融合达到80%～90%的时候， 继续以1∶3的密度传代扩增培养， 取第3代BMSCs细胞制成单细胞悬液， 将细胞浓度调整为1×106/ml备用。

1. 4 白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠模型制备及治疗 参照预实验结果， 分别对45例实验大鼠给予白毒伞粗毒素0.5 mg/kg剂量灌胃1次， 48 h后即可制备稳定的白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠动物模型。造模成功后通过腹腔注射和经尾静脉注射对两治疗组大鼠实施BMSCs的输注治疗， 共3次， 1次/d， 细胞数量1×106/（kg·次）。

1. 5 观察指标 ①SD大鼠的生存情况、体重变化情况；②治疗结束各组大鼠采尾静脉血检测肝功能及凝血功能；③治疗结束采尾静脉血测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL-6）等炎症因子含量， 评价实验SD大鼠系统性炎症反应情况。

1. 6 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 肝衰竭模型组与两治疗组大鼠生存及体重情况比较 实验结果发现， 与肝衰竭模型组比较， 治疗结束后两治疗组大鼠体重减轻明显更少（P<0.05）， 7 d生存率明显更高（P<0.05）；经腹腔注射治疗组与经尾静脉注射治疗组体重减轻及7 d生存率比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2. 2 各组大鼠肝功能指标比较 治疗后采血行肝功能检查， 结果发现与肝衰竭模型组比较， 两治疗组大鼠谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）明显降低（P<0.05）， 白蛋白（ALB）明显升高（P<0.05）；两治疗组ALT、AST、TBIL、ALB比较差异无统计学意义（P>0.05）。空白对照组ALT、AST、TBIL与其他三组比较明显降低， ALB明显升高， 比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2. 3 各组大鼠凝血功能指标和炎症因子数量比较 治疗后采血检测炎症因子和凝血功能， 结果发现与肝衰竭模型组比较， 两治疗组大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）明显降低（P<0.05）；两治疗组TNF-α、IL-6、PT、APTT比较差异无统计学意义（P>0.05）。空白对照组TNF-α、IL-6、PT、APTT与其他三组比较明显降低， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

白毒伞为剧毒蘑菇， 近年来广东地区频频发生因误食白毒伞而中毒死亡的事件。误采、误食野生蕈中毒事件中， 95%是由鹅膏蕈所致。鹅膏毒肽是鹅膏蕈所含的最重要致死毒素， 鹅膏毒肽能溶于水， 化学性质稳定， 耐高温和酸碱。食入后， 可迅速被消化道吸收进入肝脏， 并能迅速与肝细胞RNA聚合酶结合， 抑制mRNA的生成， 造成肝细胞坏死， 导致急性肝功能衰竭[3]， 严重危害人类的健康。而急性肝衰竭能否逆转主要取决于患者受损肝细胞的坏死程度以及残留肝细胞的再生能力， 因此阻断肝细胞坏死， 促进肝细胞再生是决定治疗是否成功的必要条件。

近年来， 随着干细胞研究的不断深入， 干细胞移植在肝脏疾病的治疗中也更受重视。骨髓间充质干细胞是成体干细胞的一种， 是中胚层发育的早期细胞。BMSCs不但能够与其他细胞一起支持造血干细胞的造血， 还能够在不同的诱导条件下分化成多种组织细胞， 这也使得BMSCs成为组织工程、细胞以及基因治疗最为理想的靶细胞[4]。BMSCs具有十分强的定向分化能力， 具有自体移植不排斥的优点， 在异基因移植中也能够长期存活并保持其正常的生物学功能。此外， BMSCs的来源非常广泛， 其具有采集、制备程序简单、分化能力强、性能稳定、可重复性好等优点。研究表明BMSCs具有向肝细胞分化的能力， 体外细胞因子诱导及体内实验都证明BMSCs可以分化成肝细胞或肝样细胞[5， 6]。另有实验证明BMSCs在肝脏病理条件下能够分化为具有部分生理功能的类肝样细胞， 向具有正常功能的肝细胞进行转化， 并参与修复损伤的肝脏， 发挥合成、解毒、代谢等功能， 对肝衰竭有显著的治疗作用， 降低肝衰竭的死亡率[7， 8]。这些研究结果为进一步开展BMSCs输注治疗终末期肝病创造了条件， 为白毒伞中毒致急性肝衰竭患者的治疗带来了新希望。有研究表明， 经腹腔注射BMSCs较经尾静脉注射成功率更高[9]。但经尾静脉注射可直接进入血液， 药物吸收快。因此， 两种输注途径注射骨髓间充质干细胞治疗鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效有待通过实验进行探讨。

本实验利用白毒伞粗毒素灌胃制备大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭模型， 分别通过腹腔注射和尾静脉注射途径予骨髓间充质干细胞输注治疗。研究结果显示， 进行经腹腔和尾静脉注射BMSCs移植治疗均能够显著提高AALF大鼠的一般生存情况和生存率， 显著改善AALF大鼠肝功能、凝血功能以及炎症反应情况， 且效果相当， 提示采用两种途径输注BMSCs治疗对白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分显著的疗效。这直接说明了所移植的BMSCs能够在急性肝衰竭的大鼠肝脏中转化为具有正常生物学功能的肝细胞。因此， 采用腹腔和尾静脉注射移植BMSCs治疗急性肝衰竭都是可行有效的[10， 11]。

综上所述， 采用经腹腔和尾静脉注射骨髓间充质干细胞治疗对白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分显著的疗效， 能显著改善大鼠肝功能衰竭情况， 提高生存率。如果经上述两种途径输注骨髓间充质干细胞治疗运用于临床白毒伞中毒患者， 将为广大因误食白毒伞而中毒致急性肝衰竭的患者带来巨大的福音。

参考文献

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[收稿日期：2016-03-25]