丝素蛋白纤维人工韧带的制备及性能分析

吴惠英， 周　燕， 左保齐

(1. 苏州经贸职业技术学院 纺织服装与艺术传媒学院，江苏 苏州215009； 2. 苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215006；3. 现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123)



研究与技术

丝素蛋白纤维人工韧带的制备及性能分析

吴惠英1,2， 周燕1， 左保齐2,3

(1. 苏州经贸职业技术学院 纺织服装与艺术传媒学院，江苏 苏州215009； 2. 苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215006；3. 现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123)

丝素具有良好的生物相容性，作为组织工程材料引起广泛关注。因此，结合天然丝素和再生丝素仿真构建人工韧带，在立式锭子编织机上，以再生丝素长丝为轴纱、外包天然丝素纤维编织管状结构的织物复合构建人工韧带。研究表明：采用CaCl2-FA溶液可常温条件下快速溶解蚕丝获得再生丝素溶液，通过湿法纺丝技术能够制备表面光滑且力学性能良好的再生丝素长丝。选择天然丝素纤维编织层数为9层、角度为2θ=45°±2°、中间包裹400根再生丝素长丝构建丝素蛋白纤维人工韧带，该韧带材料的断裂强力可达(1 942.6±7.5)N。体外降解实验表明，韧带材料中再生丝素长丝较天然丝素纤维有更快的降解速度。

氯化钙/甲酸；天然丝素；再生丝素长丝；人工韧带；性能；降解

人体前交叉韧带是膝关节中的重要组成部分，由致密的纤维结缔组织结构构成，其中Ⅰ型胶原约占90%，Ⅲ型、Ⅳ型胶原约占10%。纵行、致密的Ⅰ型胶原组成了直径约为20 μm的纤维，被较细的Ⅲ型胶原分隔成直径20～400 μm的纤维束[1-2]。前交叉韧带中大多数的纤维束呈纵向排列，其中也有部分纤维束呈螺旋排列[3]。目前由于剧烈运动、交通事故等因素造成的前交叉韧带的损伤现象呈逐渐上升的趋势。对于人工韧带的修复材料而言，提供足够的抗拉强度及良好的抗磨损能力是延长人工韧带使用寿命的关键因素，此外，还应具有良好的生物相容性，对人体无害、无过敏反应等性质。

在众多的人工韧带修复材料中，Altman等[4]采用蚕丝设计了钢缆式韧带，但钢缆式结构中蚕丝间排列紧密，细胞只能在支架表面上生长，很难进入支架内部。Liu等[5]将丝素制备成框架型结构后浸入到丝素溶液中形成三维空间结构构建人工韧带修复材料，但其稳定性很难控制。此外，Cooper等[6]用乳酸乙醇酸共聚物纤维结合表面多孔化技术设计人工韧带，Lu等[7]以聚乳酸和聚对苯二甲酸乙二脂为原料，Ide等[8]将聚左旋乳酸和Ⅰ型胶原混合编织，Chen等[9]将Ⅰ型胶原微孔海绵与乳酸乙醇酸共聚物结合表面网状孔隙结构等方式构建人工韧带。目前在临床中使用的LARS韧带是以涤纶为原料构建的人工韧带，它能够提供良好的机械性能，30根涤纶长丝构建的韧带材料的抗拉强力达到1 500 N，80根可达3 600 N[10]，但其仍属于永久型人工韧带，无法在体内降解，不能引导细胞生长促进人体自身韧带组织的形成。

蚕丝是由多种氨基酸组成的天然蛋白质，具有独特的理化性质及良好的生物相容性，近年来在众多生物医用高分子材料中脱颖而出，是一种可制备成如再生长丝、静电纺纳米纤维、水凝胶等多种形态的材料。本文以天然丝素和再生丝素长丝为原料，以管状结构作为人工韧带的基本结构，其中再生丝素长丝为芯纱、天然丝素纤维作为外包纱共同编织，充分发挥丝素材料的良好生物相容性，以及再生丝素长丝的可降解性和天然丝素的优良力学性质，开发可降解型人工韧带修复材料。采用氯化钙/甲酸(CaCl2-FA)溶解蚕丝获得再生丝素溶液，通过湿法纺丝技术制备再生丝素长丝。优化天然丝素纤维的编织角度，以再生丝素长丝为芯纱构建力学性能较好的人工韧带修复材料。通过体外降解实验表征以天然丝素和再生丝素长丝构建的韧带材料的降解行为。

1　实　验

1.1材料与仪器

1.1.1材料

桑蚕丝(线密度为65 dtex，浙江湖州宏成纺织有限公司)，无水碳酸钠(Na2CO3，分析纯，上海试剂总厂)，无水氯化钙(CaCl2，分析纯，上海试剂总厂)，98%甲酸(FA，分析纯，江苏强盛化工有限公司)，磷酸缓冲液(PBS，pH=7.4，上海双螺旋生物科技有限公司)，放线菌蛋白酶(Actinomycetes protease，活性单位3.5 U/mg，Sigma公司)。

1.1.2仪器

Hitachi S-570型扫描电镜(Hitachi Limited，日本)，NICOLET 5700智能型傅立叶红外光谱仪(Thermo Nicolet Corporation，美国)，Instron万能材料试验机(Instron，美国)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)，YTS 2-24型立式锭子编织机(溢泰织造机械有限公司)，MT-Ⅲ型009-300-S-D脉动无级变速器(国营宁波海洋渔业公司渔机厂)。

1.2再生丝素长丝的制备

1.2.1脱胶过程

用质量分数为0.05%的碳酸钠(Na2CO3)溶液按1︰20的浴比沸煮一定量的桑蚕丝，沸煮时间30 min，反复脱胶3次，每次脱胶后用60 ℃以上的去离子水清洗，放在60 ℃条件下的烘箱里烘干，备用。

1.2.2丝素的溶解及再生丝素长丝的制备

将脱胶桑蚕丝溶于CaCl2质量分数为5.0%、FA质量分数为95.0%的混合溶液中制备质量分数为15.0%的再生丝素溶液，溶解时间约2～4 h，所得溶液在常温下具有良好的流动性。采用湿法纺丝技术进行再生丝素长丝的制备。纺丝工艺为：纺丝温度25 ℃；凝固浴去离子水；凝固槽长度1.5 m；纺丝压力0.1 MPa；纺丝速率5 mL/h；卷绕速率10 r/min。

1.2.3人工韧带的编织工艺

采用立式锭子编织机进行编织，二维锭子编织机是由传动机构、轨道盘、携纱器、成型器及牵拉装置组成，携纱器的运动轨迹为“8”字型，该设备操作简单，编织速度可控，两组纱线互相交错形成管状织物(图1)，织物管径可根据实际需要进行调整。

图1　立式锭子编织机及其运动方式Fig.1　Vertical spindle weaving machine and its movement way

1.3测试分析

1.3.1形貌观察

利用扫描电镜观察再生丝素长丝的表面形貌，喷金厚度20～30 nm。利用Canon 650D相机高清拍摄韧带材料的形态，放大后测量纱线间夹角，并分别命名为人工韧带NSF-1，人工韧带NSF-2。

1.3.2力学性能测试

利用万能材料试验机测定材料的力学性能。力学性能测试前，先将样品置于恒温恒湿(温度为20 ℃±2 ℃，相对湿度为65%±2%)条件平衡24 h，夹持长度40 mm，拉伸速率为20 mm/min，预张力0.2 N，样品测试5个。

1.3.2体外降解性实验

放线菌蛋白酶于37 ℃溶解于0.05 mol/L (pH=7.4)的PBS溶液中，得到5 U/mL的放线菌蛋白酶溶液。降解过程中每隔2 h取出样品，同时用新配制的酶溶液更换原来的酶溶液，使其他的样品继续降解，酶溶液的体外降解实验持续15 d。取出的样品加入50 mL蒸馏水浸泡1 d，反复清洗，除去无机盐，室温干燥。将降解后的材料干燥后进行表面形貌观察。

2　结果与分析

2.1再生丝素长丝的性能

2.1.1再生丝素长丝的表面形貌

湿法纺丝过程中，纺丝液细流与凝固剂接触后，改变了纺丝液细流的相平衡，使聚合物和溶剂分离，纺丝液中的溶剂和盐向外扩散，凝固剂向内扩散，最终形成固相的纤维。前期的研究过程中发现[11-13]，采用CaCl2-FA溶解方式可以快速制备得到再生丝素溶液，不需要浓缩即可纺丝，更为重要的是丝素溶液中含有尺寸不一的纳米原纤结构，而原纤结构正是天然蚕丝优良力学性能的关键因素。因此，采用含有原纤结构的丝素溶液进行纺丝，所得再生丝素长丝的性能也会有所提高。通过纤维的表面形貌观察发现(图2)，采用质量分数为15%的再生丝素溶液所制备的再生丝素长丝表面光滑，直径均匀，纤维直径为(11.2±3.5)μm，内部结构紧密；将其纤维表面放大5万倍时，纤维表面可以清晰观察到原纤结构，这说明再生丝素溶液中的纳米原纤结构在湿法纺丝过程中又重组成再生丝素长丝。

图2　再生丝素长丝的表面形貌Fig.2　Morphologies of silk fibroin filaments

2.1.2再生丝素长丝的力学性能

将再生丝素长丝分别拉伸2、3、4倍后进行力学性能测试，结果如表1所示。拉伸处理可以进一步提高长丝的取向排列和结晶度，从而使长丝的力学性能得到改善，表1显示牵伸4倍后纤维的断裂应力可达(358.4±43.2)MPa。

表1　不同倍数拉伸后丝素长丝的力学性能Tab.1　Mechanical properties of SF filaments under different drawing ratios

2.2天然丝素纤维韧带材料的力学性能

2.2.1材料的受力分析及编织角度的选择

图3　人体韧带的力学行为特征Fig.3　Mechanical behavior features of human ligament

人体前交叉韧带在外力拉伸过程中表现出三个阶段的行为变化[14]，如图3所示。非线性区：在低应力作用下韧带的变形不明显。在这一过程中，当外力作用于韧带组织时，首先将力转移到胶原纤维中导致纤维间横向的收缩，同时纤维中卷曲的结构被拉直。线性区：在这一阶段斜率增加，随着纤维卷曲的结构被拉直后，外力会直接作用到胶原分子中。胶原纤维的螺旋结构被拉直，同时横向连接的原纤结构发生相对滑移，导致单位应变下应力的增加，斜率增加。屈服区：在这一区域表现为斜率的下降，同时原纤结构断裂。在这一区域，韧带中原纤结构的断裂导致胶原纤维断裂，最终引起韧带断裂，应力-应变曲线中斜率降低。为了更好地恢复膝关节作用，韧带替代材料需要具备与正常前交叉韧带相似的生物力学性质才能更好发挥韧带的功能作用。本文分别采用两种角度进行韧带材料的编织，放大后测量两种韧带材料纱线间的夹角2θ分别为45°±2°和95°±2°，其中θ为编织角，实物如图4所示，材料拉伸时的受力分析如图5所示。

图4　不同编织角度构建的人工韧带材料Fig.4　Artificial ligament constructed with different braiding angle

图5　人工韧带材料拉伸过程受力分析Fig.5　Analysis of stress of artificial ligament in stretching process

由图5可知，材料所受力的作用满足关系式：

B=TSX=TS·sinθ

(1)

T=TSy=TS·cosθ

(2)

式中：θ为编织角；T为轴向拉力；B为法向力；Ts为沿纱线方向拉力。

编织角度是影响韧带材料受力过程中非线性区的长度及断裂强力的关键因素。随着编织角度的增加，外力首先是将与轴向呈一定夹角的纱线由偏移轴方向的位置拉伸转移至与轴平行的位置，然后再作用于这些被拉直的纱线。本文以天然丝素纤维构建的NSF-1，即2θ=45°±2°，力的作用首先是将纱线从与轴向呈夹角的位置转移到与轴向平行的位置，即在低应力作用下韧带材料发生的变形，变形会持续一段时间直至伸直，再将外力转移至与轴向平行的纱线中。在这一过程中，材料的变形及受力情况与人体前交叉韧带变形过程很相似。随着编织角度的继续增加，如本文的天然丝素纤维构建的NSF-2，即2θ=95°±2°，纱线间夹角过大，当外力作用于纱线后，纱线由倾斜到与轴向平行的转变过程所需时间较长，形变量过大。因此综合考虑形变及断裂强力等因素，本文选用2θ=45°±2°作为天然丝素纤维的编织角度。

2.2.2力学性能测试

为了讨论不同层数对材料力学性能的影响，采用两种不同编织角度分别编织1、3、6、9层，图6为NSF-1、NSF-2的力学性能。图6可见，随着编织层数的增加，材料的断裂强力逐渐增加。力学测试结果表明，NSF-1的编织层数为9层，纱线间夹角2θ=45°±2°时，材料的断裂伸长为33.5%±6.1%，与人体前交叉韧带的断裂伸长率约为33%相近。同时，材料的断裂强力达到(1523.2±18.3)N，与人体前交叉韧带的断裂强力(2160±157)N[4]相近。而NSF-2的编织层数为9层，纱线间夹角2θ=95°±2°时，断裂强力和断裂强度与NSF-1的结果相近，但断裂伸长率达到了63.7%±2.5%，几乎达到了人体前交叉韧带断裂伸长率的2倍，变形较大。这与前面所讨论的受力分析过程中纱线夹角与力学行为间的关系结论一致。

2.3丝素蛋白纤维人工韧带的构建及性能

2.3.1丝素蛋白纤维人工韧带的构建

将制备的再生丝素长丝集束收集后平行排列作为轴纱、天然丝素纤维作为外包纱线相互交错进行编织构建丝素蛋白纤维人工韧带修复材料，如图7所示。结合人体断裂强力、断裂伸长率、断裂强度等参数，选择天然丝素纤维编织层数为9层，编织角度控制在2θ=45°±2°，中间包裹400根再生丝素长丝构建丝素蛋白纤维人工韧带。在该结构中既有平行排列又有相互交叉排列的两种纤维共同组成，结构形态上与人体前交叉韧带相近。

图7　丝素蛋白纤维人工韧带的构建Fig.7　Construction of artificial ligament with silk fibroin

2.3.2丝素蛋白纤维人工韧带的力学性能

将丝素蛋白纤维人工韧带进行力学性能测试，结果如表2所示。在受到外力拉伸作用后，包裹在芯部的长丝受到外包天然丝素纤维的保护，天然丝素纤维首先受到力的作用，随着纤维间的夹角逐渐

表2　丝素蛋白纤维人工韧带的力学性能Tab.2　Mechanical properties of artificial ligaments constructed with silk fibroin

减小，两种纤维都受到外力作用，其最终的断裂强力可以达到(1 942.6±7.5)N，较纯天然丝素纤维构建的人工韧带在力学性能上有所提高，这说明再生丝素长丝在其中起到了一定的作用。

2.3.3丝素蛋白纤维人工韧带的降解性能

将丝素蛋白纤维人工韧带放置于放线菌蛋白酶溶液中进行体外降解实验，分别在降解5 d(图8)和15 d(图9)时选择天然丝素纤维中最外层、最里层及位于芯纱部位的再生丝素长丝进行表面形貌观察。研究发现，天然丝素纤维在降解液中的性质较稳定，降解5 d时纤维几乎没有发生变化，而处于芯部的再生丝素长丝在外包纤维的保护下，其纤维形态也较完整。当降解15 d时，随着降解液对纤维的不断降解，外层的天然纤维出现了劈裂现象，而里层纤维仍保持规整的结构。然而随着外层纤维发生逐渐降解，降解液渗透到内部，对再生丝素长丝作用逐渐加强，再生丝素长丝纤维降解严重、形态模糊。降解实验表明，在丝素蛋白纤维人工韧带材料中，表现出天然丝素纤维降解速度缓慢、再生丝素长丝降解速度快的降解差异，实现了可降解型人工韧带的设计要求。

图8　材料降解5 d时纤维表面形貌观察Fig.8　Morphologies of fibers after degradation for 5 days

图9　材料降解15 d时纤维表面形貌观察Fig.9　Morphologies of fibers after degradation for 15 days

3　结　论

本文采用天然丝素纤维和再生丝素长丝以管状织物的结构形态构建人工韧带，研究表明：采用CaCl2-FA溶解蚕丝可快速获得再生丝素溶液，同时该溶液具有良好的可纺性，通过湿法纺丝技术能够制备表面光滑且力学性能良好的再生丝素长丝。选择天然丝素纤维编织层数为9层、编织角度控制在2θ=45°±2°、中间包裹400根再生丝素长丝构建丝素蛋白纤维人工韧带，该韧带材料的断裂强力可达(1 942.6±7.5)N。从韧带材料中纤维的表面形貌观察发现，再生丝素长丝较天然丝素纤维有较快的降解速度。

[1]PETERSEN W, TILLMANN B. Anatomy and function of the anterior cruciate ligament[J]. Der Orthopade,2002,31(8):710-718.

[2]JAMISON S T, MCNALLY M P, SCHMITT L C, et al. The effects of core muscle activation on dynamic truck position and knee abduction moments: implication for ACL injury[J]. Journal of Biomechanics,2013,46(13):2236-2241.

[3]LEONG N L, FRANK F A, DAVID R M. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction[J]. Journal of Biomedical Materials Research: Part A,2014,102(5):1614-1624.

[4]ALTMAN G H, HORAN R L, LU H H, et al. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J]. Biomaterials,2002,23(20):4131-4141.

[5]LIU H F, LIU H B, SIEW L T, et al. A comparison of rabbit mesenchymal stem cells and anterior cruciate ligament fibroblasts responses on combined silk scaffolds[J]. Biomaterials,2008,29(10):1443-1353.

[6]COOPER J A, LU H H, KO F K, et al. Fiber-based tissue-engineered scaffold for ligament replacement: design considerations and in vitro evaluation[J]. Biomaterials,2005,26(13):1523-1532.

[7]LU Q, SIMIONESCU A, VYAVAHARE N. Novel capillary channel fiber scaffolds for guided tissue engineering[J]. Acta Biomaterialia,2005,1(6):607-614.

[8]IDE A, SAKANE M, CHEN G P, et al. Collagen hybridization with poly L-lactic acid braid promotes ligament cell migration[J]. Materials Science and Engineering C,2001,17(1):95-99.

[9]CHEN G P, SATO T, SAKANE M, et al. Application of PLGA-collagen hybridmesh for three-dimens ional culture of canine anterior cruciate ligament cells[J]. Materials Science and Engineering C,2004,24(6):861-866.

[10]NAU T, NLAVOIE P, DUVAL N. A new generation of artificial ligaments in reconstruction of the anterior cruciate ligament[J]. Journal of Bone and Joint Surgery,2002,84(3):356-360.

[11]WU H Y, ZHANG F, YUE X X, et al. Wet-spun silk fibroin scaffold with hierarchical structure for ligament tissue engineering[J]. Materials Letters,2014,135:63-66.

[12]YUE X X, ZHANG F, WU H Y, et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution[J]. Materials Letters,2014,128:175-178.

[13]吴惠英,左保齐,周燕.氯化钙/甲酸溶解体系下氯化钙质量分数对蚕丝溶解性的影响[J].纺织学报,2014,35(12):1-6.

WU H Y, ZUO B Q, ZHOU Y. Effect of CaCl2concentration on solubility of silk in CaCl2-formid acid system[J]. Journal of Textile Research,2014,35(12):1-6.

[14]JOSEPH W F, MIA D W, CATO T L. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design[J]. Journal of Biomechanics,2007,40:2029-2036.

Preparation of artificial ligament with silk fibroin and analysis of its property

WU Huiying1,2, ZHOU Yan1, ZUO Baoqi2,3

(1. School of Textile and Clothing and Arts and Media, Suzhou Institute of Trade & Commerce, Suzhou 215009, China;2. College of Textile & Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215123, China; 3. National Engineering Laboratory for Modern Silk, Suzhou 215123, China)

Silk fibroin has2-Formid Acid solution quickly to gain regenerated silk fibroin solution, and silk fibroin filaments with smooth surface and good mechanical property can be obtained by wet spinning technology. The breaking strength of ligament can reach (1 942.6±7.5)N under the following conditions: 9 layers of natural silk fibroin, angle 2θ=45°±2°, and 400 filaments as core yarns. The degradation tests demonstrate that regenerated silk fibroin filaments degrade faster than natural silk fibroin.

extensive attention as a choice for tissue engineering material because of its good biocompatibility. In this paper, composite silk fibroin ligament was constructed with natural silk fibroin and regenerated silk fibroin by using vertical spindle knitting machine. In the artificial ligament, regenerated silk fibroin filaments were braided as core yarns and natural silk fibroin was braided outside. The results indicate that at room temperature silk van be dissolved in CaCl

calcium chloride/formic acid; natural silk fibroin; regenerated silk fibroin filament; artificial ligament; property; degradation

10.3969/j.issn.1001-7003.2016.07.001

2015-09-21;

2016-06-02

国家茧丝绸发展专项资金资助项目(国茧协办函〔2015〕32号)；江苏省应用基础研究计划项目(BK2014 1207)；苏州市应用基础研究计划项目(SYG201431)；中国纺织工业联合会科技指导性项目(2015009)；苏州经贸职业技术学院自然基金项目(KY-ZR1501)

TS102.33

A

1001-7003(2016)07-0001-06引用页码: 071101