不同基础培养基对漏斗形马勃菌丝体生长的影响

王 君， 田 强， 游 朗， 李玉延， 宋力雅， 马 林,2*

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010)



不同基础培养基对漏斗形马勃菌丝体生长的影响

王 君1， 田 强1， 游 朗1， 李玉延1， 宋力雅1， 马 林1,2*

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010)

[目的]研究漏斗形马勃在7种不同基础培养基上的生长情况。[方法]采用7种基础培养基进行试验，通过液体和固体培养，以菌丝体生物量及菌落直径为指标，确定漏斗形马勃的最佳基础培养基。[结果]最适合漏斗形马勃生长的基础培养基配方为玉米渣4%、蛋白胨0.3%、蔗糖2%、KH2PO41%、MgSO40.05%。在28 ℃和摇床转速150 r/min条件下，液体培养5 d后的菌丝体干重为16.56 g/L。在28 ℃固体培养7 d，菌丝体鲜重和干重分别为16.47和2.27 g/L，菌落直径为4.49 cm。[结论]该研究为漏斗形马勃培养条件的进一步优化奠定了基础。

漏斗形马勃；固体培养；液体培养；培养基；菌丝体；生长

中药马勃资源丰富、来源广泛，分属于担子菌门不同科属，常见种类包括脱皮马勃、大秃马勃、梨形马勃、头状马勃、硬皮马勃等。马勃类真菌主要含有多糖、蛋白质、氨基酸、多肽、脂肪酸以及甾体、萜类、生物碱、酰胺类化合物等次生代谢成分，具有抑菌、抗炎、清除自由基、抗肿瘤、止咳、止血等多种药理作用[1-3]。

漏斗形马勃(Lycoperdonexcipuliforme)为伞菌纲伞菌目蘑菇科真菌，其子实体中型，成熟后顶部开口，呈漏斗状。夏秋季生长在阔叶树林中地上及路边[4]。马勃主要以子实体为入药部位，但由于对生长环境有一定的要求，虽分布广泛，其野生成熟子实体很少，单靠采集野生子实体难以满足需求。利用液体发酵人工培养，可以在短期内获得大量的马勃菌丝体。有关马勃类真菌的液体培养已有一些报道，涉及碳源和氮源筛选、无机盐添加、培养条件优化等，这些研究采用了不同的基础培养基，所获得的菌丝体生物量具有较大的差异[5-8]。但目前尚无漏斗形马勃人工培养的研究，该研究采用7种基础培养基进行试验，以菌丝体生物量及菌落直径为指标，确定漏斗形马勃的最佳基础培养基，为进一步优化漏斗形马勃的培养条件奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料漏斗形马勃(Lycoperdonexcipuliforme)由西南科技大学生命科学与工程学院贺新生教授提供，4 ℃保存于PDA培养基上。葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾均为分析纯试剂，土豆、玉米渣、黄豆粉购自绵阳当地市场。

1.2方法

1.2.1菌种活化。将4 ℃保存的漏斗形马勃菌种取出，在无菌环境下接种在培养皿固体PDA培养基上。置于培养箱在28 ℃培养5 d。

1.2.2培养基组成。共采用7种基础培养基(编号为I～VII)进行试验。I号为培养真菌常用的PDA培养基，II～VII号培养基参考相关文献。各培养基具体组成为：I马铃薯20%、葡萄糖2%[9]；II马铃薯20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%[5]；III蛋白胨1%、酵母膏0.2%、MgSO41.5%、KH2PO42.0%[6]；IV玉米渣4%、蛋白胨0.3%、蔗糖2%、KH2PO41%、MgSO40.05%[7]；V葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、黄豆粉1.5%[8]；VI马铃薯20%、黄豆粉1%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%[10]；VII葡萄糖1%、MgSO41.5%、KH2PO42.0%[6]。

1.2.3培养基配制。

1.2.3.1液体培养基配制。按照“1.2.2”培养基组成比例配制，pH均为自然。分装后在121 ℃灭菌20 min。

1.2.3.2固体培养基配制。按照“1.2.2”培养基组成比例配制，并在每个培养基中按18 g/L加入琼脂，121 ℃灭菌20 min后按20 mL装量倒入90 mm培养皿固化。

1.2.4液体培养。在250 mL锥形瓶中装量液体培养基100 mL，在无菌条件下，用直径6 mm的打孔器取活化菌种的菌饼2块，放入锥形瓶中，使其分散。置于恒温摇床中振荡，转速为150 r/min，培养温度为28 ℃，培养时间为5 d。每一培养基处理设5次重复。重复3次试验。

1.2.5固体培养。培养皿固体培养基凝固后放置30 min，在无菌条件下，用直径6 mm的打孔器取活化菌种的菌饼1块，接种在培养皿中央。恒温培养箱中28 ℃培养7 d。每一培养基处理设5次重复。重复3次试验。

1.2.6菌丝体生物量及固体培养菌落直径测定。液体培养5 d后，将培养液用真空泵抽滤，收集菌丝体，用蒸馏水充分洗涤，置于培养皿烘干至恒重。固体培养7 d后，用游标卡尺在十字交叉的2个方向进行测量，以二者的平均值作为菌落直径，菌丝体除去粘附在上面的琼脂并用蒸馏水充分洗涤，用滤纸吸干水分，称量鲜重。烘干至恒重测菌丝体干重。

1.3数据统计分析以每次试验每个处理的5个重复计算平均值，将3次试验的结果进行方差分析，不同处理间差异显著性用LSR法进行多重比较。

2　结果与分析

2.1不同基础培养基液体培养对菌丝体生物量的影响由表1可见，在培养条件(pH、接种量、培养温度、培养时间和转速)相同的情况下，采用不同基础培养基培养所获的菌丝体干重有较大差异。IV号培养基的菌丝体干重最大，为16.56 g/L，其次是V号培养基，菌丝体干重为10.25 g/L，其余培养基(I、II、III和VI)均在8 g/L以下，III号培养基的菌丝体干重最低，仅为2.17 g/L，而VII号培养基在接种后没有观察到菌丝体生长。对I～VI号6个处理试验结果进行方差分析发现，F值为28.21，大于F0.01=5.06，表明各处理间的差异达到极显著。多重比较结果表明，IV号培养基的菌丝体干重极显著高于其他5种培养基，V号与VI号培养基之间未达显著差异，但显著高于另外3种培养基。

表1不同基础培养基液体培养的漏斗形马勃菌丝体干重

Table 1Dry weight ofL.excipuliformemycelia in various basic media in liquid culture

培养基编号Numberofeachmedium菌丝体干重Dryweightofthemycelia∥g/L差异显著性SignificanceofdifferenceP<0.05P<0.01I5.41±0.65cCII6.76±0.66cBIII2.17±1.01dCIV16.56±0.60aAV10.25±2.03bBVI7.52±3.01bBVII—

注：图中不同大写字母表示培养基之间的差异达极显著水平(P<0.01)，不同小写字母表示培养基之间的差异达显著水平(P<0.05)。Note：Different capital letters and lowercase letters mean the differences between various media were extremely significant P<0.01) and significant (P<0.05) respectively.图1　不同基础培养基固体培养的漏斗形马勃菌丝体生物量Fig.1　Mycelium biomass of L. excipuliforme in various basic media in solid culture

2.2不同基础培养基固体培养对菌丝体生物量的影响从图1可看出，在培养条件相同情况下，不同基础培养基上所获得的菌丝体鲜重及干重均有一定差异。从菌丝体鲜重看，IV号培养基最大，为16.47 g/L，其次是VI号培养基(14.83 g/L)，IV号和VI号之间无显著差异，但均极显著高于另4个培养基(I～III和V号)；鲜重最少的是I号培养基(7.20 g/L)。与液体培养时相似，漏斗形马勃菌种接种与VII号固体培养基也未见生长。干重测定结果表明，IV号培养基达最大，为2.27 g/L，极显著高于其他5个基础培养基的菌丝体干重，III号培养基的菌丝体干重为1.77 g/L，极显著高于I、II、V和VI号培养基，I号培养基的菌丝体干重仅为0.38 g/L。2.3不同基础培养基固体培养的菌落直径由表2可见，在培养温度和时间相同的情况下，不同基础培养基对漏斗形马勃的生长有较大影响。菌落直径最大的是IV号培养基，为4.49 cm，极显著高于其他基础培养基。VI号也有较大的菌落直径(3.25 cm)，II、III和V号培养基的菌落直径之间无显著差异，菌落直径最小的是I号基础培养基(1.89 cm)。VII号培养基未观察到菌丝体出现。

表2　漏斗形马勃固体培养的菌落直径

3　结论与讨论

该研究表明，无论是液体培养还是固体培养，IV号培养基在菌丝体生物量上均达到最大值，液体培养的菌丝体干重为16.56 g/L，固体培养的菌丝体鲜重和干重分别为16.47和2.27 g/L。IV号培养基的氮源为蛋白胨(0.3%)，碳源为蔗糖(2%)，所添加的玉米渣(4%)含有蛋白质、淀粉、氨基酸等多种营养成分[11]，能够满足菌种生长的碳氮需求，配方中的KH2PO4(1%)和MgSO4(0.05%)也有利于菌种的生长。同样采用IV号培养基作为基础培养基，王涛等[7]培养大秃马勃的研究表明，不同碳源条件下的菌丝体干重为4.01～9.37 g/L，不同氮源条件下的菌丝体干重为4.93～9.04 g/L，菌丝体生物量总体低于该研究的结果，这可能与菌种、培养条件(温度、转速、培养时间等)及培养基主要成分的来源(如玉米渣品质)不同有关。采用V号培养基作基础培养基也能获得较好的效果(液体培养菌丝体干重为10.25 g/L)，但杨小方等[8]用该基础培养基进行脱皮马勃液体培养，发现不同培养条件下所测得的菌丝体干重差异较大(5.3～28.0 g/L)，说明在基础培养基上改变碳源和氮源、添加无机盐的种类及比例、优化组合不同条件等对结果均有很大影响。以III号培养基作基础培养基，液体培养仅获得2.17 g/L的菌丝体干重，可能与配方中碳源比例不足有关。VII号培养基接种后未见生长，可能与缺乏氮源有关。

从固体培养的菌落直径同样可以看出，IV号培养基相比其他培养基生长更为快速，这与生物量测定所反映出的结果一致，但III号和VI号培养基的菌落直径大小与其鲜重、干重并不成正比，可能与培养基不同导致菌丝体积累的干物质量不同有较大关系。孔超等[10]对马勃464菌株进行固体培养，发现培养基中采用不同碳源或不同氮源时，对菌丝体日均生长量具有较大影响。

在基础培养基上，通过单因素试验或正交试验进行培养基配方和培养条件优化，可以大幅度提高菌丝体生物量[7-8]，因此，该研究筛选获得的IV号培养基可以作为漏斗形马勃的基础培养基，有利于进一步开展最适碳氮源及最佳碳氮比筛选、无机盐添加以及培养条件优化等研究。

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Effects of Different Basic Media on the Mycelium Growth ofLycoperdonexcipuliforme

WANG Jun1，TIAN Qiang1，YOU Lang1，MA Lin1,2*et al

(1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010; 2. Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province，Mianyang，Sichuan 621010)

[Objective] To study the mycelium growth ofLycoperdonexcipuliformein seven basic media. [Method] According to medium biomass and colony diameter as growth parameters，the optimal basic medium for the mycelium growth ofL.excipuliformewas selected from seven liquid and solid media with different constituents. [Result] The optimal basic medium for the mycelium growth ofL.excipuliformewas the IV medium composed of maize (4%)，peptone (0.3%)，sucrose (2%)，KH2PO4(1%) and MgSO4(0.05%). After the mycelia were cultured in the liquid medium at the rotational speed of 150 r/min at 28 ℃ for 5 d，their dry weight in the IV medium was 16.56 g/L. When the mycelia were cultured in solid medium at 28 ℃ for 7 d，their fresh weight and dry weight in the IV medium were 16.47 and 2.27 g/L respectively，and the colony diameter was 4.49 cm. [Conclusion] The study lays the foundation for the further optimization of culture conditions ofL.excipuliforme.

Lycoperdonexcipuliforme; Solid culture; Liquid culture; Culture medium; Mycelium; Growth

国家大学生创新创业训练计划(201410619002)；西南科技大学大学生创新基金(CX15-040)；西南科技大学生命科学与工程学院大学生创新实践项目(2014011)。

王君(1994- )，女，四川成都人，本科生，专业：制药工程。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事天然产物研究。

2016-06-08

S 567.3

A

0517-6611(2016)19-114-03