Undifilum oxytropis次级代谢产物GC-MS分析及抗肿瘤活性研究

刘忠艳，薛瑞旭，吴庆侠，董海龙，李　鹏，金艺鹏，林德贵（.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000；.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 700；.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 009）

Undifilum oxytropis次级代谢产物GC-MS分析及抗肿瘤活性研究

刘忠艳1，薛瑞旭2，吴庆侠1，董海龙1，李鹏3，金艺鹏3，林德贵3
（1.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；3.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

研究疯草内生真菌（Undifilum oxytropis），次级代谢产物成分与活性，通过GC-MS对菌丝体及发酵液进行了分析，并通过MTT法测定抗肿瘤活性。结果表明，菌丝体和发酵液中均以烷烃和酯类物质为主，菌丝体中检出活性物质角鲨烯（0.863%）；菌丝体对HCT-8人回盲肠癌细胞和OS-RC-2人肾癌细胞抑制率均较高，发酵液对HCT-8人回盲肠癌细胞抑制率相对较弱。

疯草；内生真菌；代谢产物；抗肿瘤

Corresponding authors：LI Peng；JIN Yi-peng

疯草（locoweed）是一类含有毒性成分苦马豆素（Swainsonine），并能引起动物出现典型神经症状和广泛空泡变性的黄芪属（Astragalus）和棘豆属（Oxytropis）有毒植物的总称，是世界范围内分布最为广泛、危害最为严重的毒草[1-2]。苦马豆素属吲哚里西啶类（indolizidine）生物碱，该类生物碱具有多样的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抑菌等。2003年，国外学者Braun等从疯草中分离到内生真菌，之后国内外学者相继从疯草中分离到内生真菌，并得到产苦马豆素活性菌株，经鉴定为Undifilum spp.同时证明其与疯草中苦马豆素的产生存在一定关系[3-8]。

内生真菌已成为生物活性次级代谢产物的一个重要来源。内生真菌的多样性、复杂性和特殊性的特点，使其产生的活性产物的结构类型远远超出它们的寄主植物，而且，内生真菌产生新颖化学结构的代谢产物的比例（51%）比土壤微生物（38%）要高很多，因此内生真菌也成为生物活性产物筛选热点[9-10]。本文以Undifilum oxytropis为样本，通过GC-MS分析次级代谢产物小极性段化学成分，同时通过MTT法研究其抗肿瘤活性，为其活性产物筛选奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料茎直黄芪内生真菌Undifilum oxytropis，由西北农林科技大学动物医学院生物毒素与分子毒理试验室提供。HCT-8人回盲肠癌细胞、OS-RC-2人肾癌细胞，由中国科学院细胞库提供。

1.2次级代谢产物分析培养过滤得到的Undifilum oxytropis菌丝和浓缩发酵液采用乙醇热回流法提取其代谢产物，制得浸膏悬浮于蒸馏水，后经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分段萃取，分别得到各自萃取段。其中石油醚萃取段采用GC-MS进行分析。

气相色谱条件：色谱柱为ZB-SMSI 5%Phe⁃nyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温60℃（保留2 min），以5℃/min升温至310℃，保持10 min；运行时间：60 min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦气；柱前压7.65 psi，载气流量1.0 mL/min，不分流，溶剂延迟时间：3.0 min。

质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 294 V；接口温度280℃；质量范围29～500 amu。

1.3抗肿瘤活性研究HCT-8人回盲肠癌细胞、OS-RC-2人肾癌细胞接种于96微孔板，37℃、5% CO2培养至对数期。设3个平行组。阴性对照组添加细胞培养液200 μL，试验I-VII组按38 μg/ μL、19 μg/μL、9.5 μg/μL、4.75 μg/μL、2.375 μg/ μL、1.188 μg/μL、0.594 μg/μL梯度浓度加入菌丝乙醇提取物，按170 μg/μL、85 μg/μL、42.5 μg/ μL、21.25 μg/μL、10.625 μg/μL、5.313 μg/μL、2.656 μg/μL梯度浓度加入发酵液乙醇提取物，培养36 h。分别加入0.5%MTT溶液20 μL培养4 h，弃去培养液加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡至甲臜紫色结晶溶解完全，酶标仪490 nm测其OD值。按下列公式计算癌细胞抑制率。

癌细胞抑制率=（1-给药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%

2　结果

2.1GC-MS检测结果按照上述条件对Undifilum oxytropis菌丝体和发酵液乙醚提取样品进行分析，分别获得其总离子流色谱图（图1和图2），对色谱图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2008和Wiley275标准质谱图，分别鉴定出菌丝体和发酵液样品中的22个和28个化合物，未定化合物分别为5个和10个，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对百分含量，鉴定出的化合物分别占总提取物的88.580%和66.734%，结果见表1和表2。

图1　Undifilum oxytropis菌丝体总离子流色谱图

图2　Undifilum oxytropis发酵液总离子流色谱图

表1　菌丝体石油醚萃取段GC-MS检测结果

Undifilum oxytropis菌丝体中油酸（39.82%）、油酸甲酯（21.531%）、棕榈酸（10.336%）、棕榈酸甲酯（5.306%）等含量较高，发酵液中则以苯二甲酸丁酯（40.643）含量最高。菌丝体和发酵液中均以烷烃和酯类物质为主，同时菌丝体中还检测到活性物质角鲨烯，其含量为0.863%。

2.2抗肿瘤活性研究Undifilum oxytropis菌丝体乙醇提取物对HCT-8、OS-RC-2均有较强的抑制作用，其半数抑制浓度分别为9.5 μg/μL和2.375 μg/ μL，发酵液乙醇提取物对OS-RC-2抑制作用较强，半数抑制浓度为42.5 μg/μL，对HCT-8则相对较弱，半数抑制浓度为170 μg/μL。结果见图3。

表2　发酵液石油醚萃取段GC-MS检测结果

图3　UNDIFILUMOXYTROPIS菌丝体与发酵液肿瘤细胞抑制曲线

3　讨论

本文从Undifilum oxytropis菌丝体和发酵液中检出化合物均以烷烃类和酯类化合物为主，同时含有少量的挥发性酸，菌丝体检出化合物种类低于发酵液中化合物检出种类。从菌丝体中检测到的角鲨烯具有促进动物机体组织携氧、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抑制微生物生长等能力[11]。王建军[12]还首次从疯草植物茎直黄芪中分离得到角鲨烯，可以推测其产生也可能与Undifilum内生菌有关。从发酵液中检测出的异黄蝶呤常被用作肿瘤标志代谢物进行研究，其具有抗肿瘤、抗突变等作用[13-14]。

Undifilum oxytropis菌丝体和发酵液均具有明显的抑制肿瘤活性，且抗肿瘤活性物质主要分布于菌丝体中。因疯草中活性成分吲哚里西啶类生物碱主要为大极性物质，因此其抗肿瘤活性是否完全与苦马豆素有关还需对其次级代谢产物大极性段进行研究。

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GC-MS and antitumor activity study on thesecondary metabolites ofUndifilum oxytropis

LIU Zhong-yan1，XUE Rui-xu2，WU Qing-xia1，DONG Hai-long1，LI Peng3，JIN Yi-peng3，LIN De-gui3
（1.Tibet Agriculture and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China；2.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；3.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to study the active ingredients of secondary metabolites in locoweed endophyte，Undifilum oxytropis，the mycelium and fermentation broth were analyzed by GC-MS，and antitumor activity was measured by MTT assay.It showed that：al⁃kanes and esters were mainly active substances in both mycelium and fermentation broth.And squalene（0.863%）was detected in the mycelium；HCT-8 human ileocecal cancer and OS-RC-2 human renal cancer were highly inhibited by the mycelium.Inhibi⁃tion rate of fermentation broth to HCT-8 human ileocecal cancer was relatively weak.

locoweed；endophyte；metabolites；antitumor

S856.9

A

0529-6005（2016）07-0019-03

2016-02-23

中国农业大学基本科研业务经费专项资金（2015-TC027）；西藏自治区科技厅自然科学基金（2015ZR-13-31）

刘忠艳（1982-），男，讲师，硕士，主要从事动物中毒性与营养代谢性疾病研究，E-mail：yjkdhqc@163.com

李鹏，E-mail：Vetli@cau.edu.cn；金艺鹏，E-mail：yipengjin@sina.com