电喷雾质谱技术在中药分析中的应用*

牛燕燕，郑彩娟，罗由萍

(海南师范大学化学与化工学院，海南　海口　570100)



电喷雾质谱技术在中药分析中的应用*

牛燕燕，郑彩娟，罗由萍

(海南师范大学化学与化工学院，海南海口570100)

电喷雾电离技术(Electrospray ionization, ESI)是具有高灵敏度的气相离子软电离技术。结合中药有效成分复杂，含量低等特点，从化合物结构分析、中药质量控制和药物代谢三方面阐述了ESI-MS技术在中药分析领域的应用和发展。通过分析离子裂解途径，对化合物结构进一步确认，指导发现特异性微量化合物；建立中药有效成分化学指纹图谱，对中药质量快速准确控制，确保中药用药安全；研究化合物体内代谢途径及代谢产物，表征化合物药理效应，指导临床用药。

电喷雾电离质谱；裂解途径；质量控制；药物代谢

中药是我国古代劳动人民在长期实践过程中积累起来的宝贵医药遗产，为中华民族的繁衍昌盛做出了重要贡献，对世界文明的进步产生了积极的影响。我国幅员辽阔，地域差异显著，有利于构成我国中药资源的多样性。因为中药成分复杂，有效成分含量低，各组分性质各异，对环境(如温度、湿度等)较为敏感[1]，近年来，一些新型的分析方法和实验手段应用于中药研究领域，使得其分析的有效成分种类不断拓展，分析速度和准确性也不断提高。电喷雾电离质谱(Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS)是一种大气压软电离质谱技术，具有准确性高、分析速度快、灵敏度高等优点，特别是各种高效分离技术与多种模式的质谱扫描技术联用，已成为分离分析复杂样品的首选方法[2-3]。

1　电喷雾电离原理

典型的ESI离子源是一个金属毛细管，样品溶液从毛细管端流出并在瞬间受到几千伏高压作用，导致待测样品以单电荷或多电荷离子形式进入高真空离子源。目前，受到广泛支持的电喷雾离子化原理是“离子蒸发模型”：在高电场梯度和壳层气作用下，样品溶液从毛细管流出，在电喷雾针出口端形成细小的带电液滴，在加热气流的作用下，液滴中的溶剂逐渐蒸发，液滴直径不断变小，表面电荷密度增加。当液滴表面电荷产生的库仑斥力大于液滴表面张力时，液滴受静电斥力而分裂成细小的液滴。这一过程反复进行，直到离子间的静电排斥力大到一定程度时，挥发度高的离子优先从液滴表面射出，形成气相样品离子通过锥孔和聚焦透镜进入质谱分析器检测。图1所示为ESI正离子模式电离示意图。由于待测样品在ESI源电离过程中，不涉及高能量的激发过程，不易发生分解，因此容易得到比较完整的准分子离子信号[3-5]。

图1　ESI正离子模式电离示意图

2　ESI-MS在中药分析领域的应用

2.1天然产物分析

中药化学组成复杂，微量成分多，但同类化合物因具有相同母核结构而在质谱裂解中往往有一定的规律可循。结合已知标准品ESI质谱裂解的分析，可以帮助我们确定中药中某些复杂的微量化学成分。同时，ESI质谱还能为有机化合物提供准确的分子量信息，对于大分子化合物(如多肽、蛋白质等)，在ESI电离源中可以带上多电荷，根据不同电荷数离子的质荷比准确计算出大分子化合物的分子质量[6-7]。质子加合物是ESI-MS软电离源中常见的准分子离子之一，质子化位点关系着进一步的反应机理，影响对整个反应步骤的理解[4]，一般认为，所有的离子裂解都是在电荷或者游离基中心的诱导下发生的，各官能团的电离能大小影响着分子离子的裂解过程[8]，因此，确定最有利的质子化位点对于分析碰撞诱导裂解(CID)过程中质子化分子离子的结构及其随后的裂解反应是非常有帮助的。此外，借助化合物中活泼氢-氘交换(H/D exchange)方法，可以进一步探寻化合物更高级别的结构[9-11]。

孙学军等[12]经在线串联LC-ESI-MS建立了单糖衍生物的电喷雾质谱裂解方法，借助糖类化合物在ESI-MS正离子模式下表现出的质子化分子离子峰和ESI-MS/MS条件下呈现出的特征碎片离子峰m/z 473，快速有效地确定出单糖类化合物的组成。李丽等[13]利用LC-MS技术研究了朝鲜淫羊藿中六个黄酮类化合物，获得了这些化合物的分子量信息，并进一步借助源内CID技术对化合物结构进行鉴定，结果表明这几种化合物均产生m/z 531和369的碎片离子峰，结合文献对比，确定这些化合物是以相同的母核(脱水淫羊藿素)为苷元的黄酮类化合物。丁健桦等[14]采用电喷雾串联质谱(ESI-MSn)技术，结合H/D交换方法，研究L-抗坏血酸质谱行为，实验表明毛细管温度对L-抗坏血酸的裂解方式产生显著影响。根据L-抗坏血酸特征碎片离子，提出了其结构变化和降解反应的可能机制和基本规律，为现代质谱技术快速测定复杂基体样品中的痕量 L-抗坏血酸奠定了实验基础。L-抗坏血酸在CID裂解时，受其他基团诱导效应的影响，碳原子上的羟基极易接受质子成为质子化的活性位点，并丢失水分子形成伯碳正离子过渡态，进一步氢重排，形成新的更加稳定的碳正离子。同时，L-抗坏血酸在MS2直接丢失中性碎片CO和CO2，但与脱除H2O相比，所需电离能则要大很多。Iyad Hailat等[15]通过ESI-IT-MSn直接进样研究了人造黄油和玉米油中脂肪酸甾醇酯的质谱行为，实验表明ESI正离子模式下，加入缓冲剂乙酸铵的脂肪酸甾醇酯极易检测到[M+NH4]+加合物，甾醇酯同分异构体可以通过MS2和 MS3碰撞诱导裂解来确定结构。

2.2质量控制

中药的整体作用特点决定了中药有别于西药，其质量控制方法对起效的全成分进行有效控制，达到控制中药质量、保证中药用药安全的目的。指纹图谱质控技术便是有效方法之一[16]，高效的分离方法和质谱快速检测的分析方法相结合，提供了准确、可靠的质量控制结果。

黄昆[17]使用UPLC-MS技术建立起萝芙木指纹图谱的中药分析方法，不仅节约了研究时间和试剂成本，而且较HPLC具有更高的分辨率和准确度。作者结合文献，对云南萝芙木甲醇提取物中利血平、育亨宾、蛇根亭碱、阿吗碱、阿吗灵、利血胺、罗尼生、坎尼生八个中药成分分离并归属。其次，对不同产地的云南萝芙木指纹图谱分析，确定了42个特征指纹峰，其中共有特征峰22个，并结合质谱和相关文献，确定了药材中部分化学成分指纹图谱的归属，通过共有峰面积的比较，说明不同产地的云南萝芙木存在一定的差异，要实现精准的质量控制，就要进行基地化建设。窦建鹏等[18]以朝鲜淫羊藿药材乙醇提取部分作为考察对象，建立该药材的HPLC梯度洗脱指纹图谱，并采用MSn方法确认了13个共有峰结构，以此作为长白山区朝鲜淫羊藿有效成分的质量检测标准。周莉莉等[19]利用HPLC-ESI-MSn联用技术，对传统中药山茱萸炮制过程中环烯醚萜苷类成分的变化进行了研究，C18反相色谱柱二元线性梯度洗脱分离得到7个环烯醚萜苷类化合物，并通过ESI一级质谱获得了分子量信息，利用CID技术，获得了该类化合物负离子模式下碎裂特征，研究结果表明，通过色谱保留时间、色谱峰面积和质谱特征信息能够提供更加准确可靠的定性定量结果。刘悦等[20]应用ESI-MSn技术对传统中药甘遂根中弱极性部分化学成分进行了分析鉴定，对甘遂氯仿提取物全扫描和串联质谱扫描数据分析，共鉴定出39个化合物，其中包括9个新化合物。王鹏[21]以蒙古黄芪为原料，研究了黄芪药材及市售黄芪注射液的特征图谱，结果显示虽然都出现了相应的主成分峰，但峰面积比值不同，说明中药注射剂必须在固定的药材产地和提取工艺等条件下，才能保证中药注射剂的质量稳定可控。

2.3药物代谢和药物动力学

药物通过各种途径进入体内后的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程，决定了药物能否有效到达目标部位并充分发挥疗效。ADME血药浓度随时间变化动态过程的定量描述即为药代动力学，对于阐明中药的药效物质基础及作用机理具有非常的意义[22]。HPLC-MS联用技术样品预处理简单，可直接用于药物及其代谢产物的分离和鉴定[23]。

Lokiec等[24]采用LC/MS和LC-MS/MS研究了20(S)-喜树碱的半合成衍生物CPT-11在临床阶段的代谢途径，发现了其体内代谢的三个主要反应：内酯位置的脱羧、7-乙基位置的氧化和二-哌啶侧链的多级氧化。赵宇峰等[25]利用ESI软电离质谱技术探讨了乌头碱在人肠内的生物转化规律，根据正离子电离条件下乌头类生物碱质子化分子[M+H]+提供的分子量信息和精确质量测定提供的元素组成及MSn提供的结构信息，对乌头碱的转化产物直接进行定性分析，研究结果表明，乌头碱在人肠内细菌环境中通过脱乙酰基、甲基、羟基和酯化反应产生新的单酯型、双酯型和脂类生物碱等二十余种转化产物。钟大放等[26]采用ESI-IT-MS对人尿样中罗红霉素及其十种代谢物进行了结构鉴定，通过质谱裂解途径研究发现，正离子模式下MS2和MS3分别生成脱红霉糖和脱氨基糖碎片，同时还观察到脱含氮烷基侧链和一系列质荷比相差18的脱水碎片离子，这些特征碎片可用于罗红霉素及其结构类似物的体内代谢转化研究。

3　展　望

随着科学技术的不断进步，各种检测设备和实验手段的不断发展，我们对中药化学成分的研究已取得了大量有意义的结果，大多数常用的中药化学成分均有文献报道[22, 27]，这为中药现代化研究打下了夯实的基础。质谱裂解规律的研究不仅可以帮助我们快速分析和确认某些特异性、微量的化合物，同时对新化合物的发现提供了指导依据。与高效的分离技术联用，可以为复杂的中药化合物体系快速分析和中药有效成分体内代谢途径研究提供准确可靠的研究基础，这对于中药质量控制和指导临床用药都具有重要的意义。未来对于如何根据已知的质谱裂解实验数据归纳出具有广泛适用性的质谱裂解规律，建立能够全面反映中药化学组成，突出其主要鉴别特征的化学指纹图谱数据库，根据代谢指纹图谱来表征中药药理效应，都将成为中药研究发展的重要课题，也将成为中药现代化发展的重要内容。

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Application of Electrospray Ionization Mass Spectrometry Technique Used in the Analysis of Traditional Chinese Medicine*

NIUYan-yan,ZHENGCai-juan,LUOYou-ping

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Hainan Haikou 570100, China)

The electrospray ionization (ESI) technique is a gas phase soft ionization technique and it can be used for the sensitive detection of large and small molecules in complex samples without sample pretreatment. ESI-MS technology application and development in the field of traditional Chinese medicine modernization expounded from three aspects: compound structure analysis, traditional Chinese medicine quality control and drug metabolism. It predicted the fragmentation pathway of proton ions and the structure of compound to find specific trace compounds. It could control the quality of traditional Chinese medicine quickly and accurately to ensure drug safety through the establishment of effective component chemical fingerprint. Further more, it could characterize the pharmacological effect and guide the clinical medication through the study of compounds in vivo metabolic pathway and metabolites.

electrospray ionization mass spectrometry; fragmentation pathway; quality control; drug metabolism and pharmacokinetic

海南师范大学校青年基金(QN1244)。

牛燕燕(1986-)，女，实验员，主要从事天然产物研究。

罗由萍(1981-)，女，实验员，主要从事天然产物研究。

O657.63

A

1001-9677(2016)05-0011-03