血药浓度分析的前处理方法及应用*

张倩影,王学生,侯　宁

(华北理工大学公共卫生学院，河北　唐山　063000)



血药浓度分析的前处理方法及应用*

张倩影,王学生,侯宁

(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063000)

血液样品的前处理是整个血药浓度分析过程的重点及难点，是分析误差的主要来源，合适的前处理方法直接影响血药浓度分析的速度、灵敏度、准确度和分析仪器的使用寿命。本文综述了近年来血药浓度分析常用的前处理方法及应用，包括蛋白沉淀法、液液萃取法、超临界流体萃取、微透析及固相萃取法的研究进展。

血药浓度分析；前处理方法；应用

血药浓度分析作为体内药物分析的重要方法，旨在通过测定药物在血液中的浓度，了解药物在血液中数量与质量的变化情况，以获得各种药物动力学参数、药物代谢的方式和途径等信息。

血药浓度分析主要应用于临床药理、临床药学、新药研发、药物滥用、药物代谢产物及内源性物质的研究等领域。①在临床药理研究中，常需测定血药浓度，以了解血药浓度与药物效应之间的关系；②在临床药学研究中，常需进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)，以提供准确的血药浓度测定值，评价治疗疗效或确定给药方案，使给药方案个体化，提高药物治疗水平，避免不良反应及毒性反应的发生，保证药物治疗的有效性与安全性，临床上主要对抗癫痫药物、强心甙类药物、抗生素、抗精神病药物、抗恶性肿瘤药物等治疗指数低、安全范围窄、毒副作用强、服药后个体差异大的药物进行血药浓度监测；③在新药研发领域，在新药研制过程中，需了解药物在动物和人体内的有关药物动力学参数(如血药浓度、血药浓度-时间曲线下面积、表现分布容积、半衰期等)以评价新药疗效；④在药物滥用研究中，如麻醉药品、精神药品滥用检测、法医毒物检测、吸毒者体内的毒物检测和运动员体内的兴奋剂(禁药)检查等，都需借助血药浓度监测和分析；⑤在药物代谢产物的研究中，血药浓度监测结果对指导药物设计、评价临床用药的安全性及合理性具有特别重要的意义；⑥在内源性物质的研究中，有些药物进入机体后，会使机体内源性物质(如激素、肾上腺素、乙酰胆碱、尿酸和葡萄糖醛酸等)的含量发生改变，这些变化对某些疾病的诊断、预防及治疗，均具有十分重要的意义[1]。

血药浓度分析常用的检测方法有光谱法、色谱法、免疫法三大类[2]，其中常用的方法为色谱法。由于血液样品组成复杂，基质干扰严重，且待测物含量低，因此，从复杂的血液样品中快速、准确地提取、分离和富集目标分析物，并达到高灵敏度的分析仪器的检测要求，就需要对血液样品进行预处理。

1　血液样品预处理

样品预处理步骤是整个血药浓度分析过程的重点及难点，是分析误差的主要来源，其耗费的时间占整个分析过程所需的三分之二以上[3-4]。样品预处理过程不仅直接影响分析的速度、灵敏度和准确度，还会影响分析仪器的使用寿命。

血液样品前处理的主要原则为[5]：①前处理过程中避免待测组分的化学变化；②避免待测组分被污染；③减少无关化合物的引入；④简化操作步骤、减少误差。其常用的处理方法有蛋白沉淀、液-液萃取、固相萃取、超临界流体萃取、微透析等。

1.1蛋白沉淀法

向血清或血浆中加入一定量的有机溶剂、无机盐或酸性物质等，沉淀样品中的蛋白质后经高速离心去除杂质的操作过程。蛋白沉淀法特别适用于强极性药物或两性类药物，这些药物难以用有机溶剂从血浆中提取。由于乙腈和甲醇对液相色谱分析和液相色谱-质谱的兼容性好，所以最常用的沉淀蛋白的有机溶剂为乙腈和甲醇[6]。其主要优点是操作简单快速，适合于检测限要求不高的分析。其主要缺点是方法粗糙，基质中的盐分及其他内源性干扰物如磷脂等不能被去除，且对于蛋白结合率较高的药物，回收率会较低。

Deng等[7]采用乙腈沉淀血浆蛋白，结合高效液相色谱串联质谱法，测定人血浆中皮肤癌药物Cobimetinib。方法的回收率为54.1%，线性范围为0.2～100 ng/mL，日间和日内精密度为9.5%和10.3%，该方法成功应用于Cobimetinib的临床药代动力学研究。牟玲丽等[8]经甲醇沉淀血浆蛋白，使用HPLC-MS/MS法测定人血浆中喹那普利及代谢产物喹那普利拉的浓度，结果表明，喹那普利与喹那普利拉质量浓度分别为4.096～1000 μg·L-1和8.192～2000 μg·L-1时线性关系良好(r2=0.9966和0.9959)，日内精密度≤6.5%，日间精密度RSD≤8.1%，回收率≥94.9%。袁文博等[9]建立直接蛋白沉淀-超高效液相色谱法测定血浆中微量氟尿嘧啶的方法。以6%高氯酸为沉淀剂，5-氯尿嘧啶为内标物，样品经涡旋振荡等处理后，高速离心获取上清液作为供试液。目标物浓度范围在0.5～50 μg/mL之间时线性关系良好(r=0.9998)，平均回收率为96.7%～106.2%，检测限为0.1 μg/mL。该方法已经被成功用于临床病人的血药浓度监测，具有良好的临床应用前景。

1.2液-液萃取法

液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)，又称溶剂萃取，是利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中而提取出来的过程[10]。其萃取效果除了取决于分析物在两相中的分配系数外，还受两种溶剂相互混溶的程度、萃取条件(温度、体积比等)、萃取次数等影响。由于多数药物为脂溶性，而血液样品中的内源性物质多为水溶性，因而在选择溶剂时应注意按照“相似相溶”的原则，使用与水不互溶(如乙醚)的溶剂，防止水溶性杂质的引入，且溶剂纯度分析纯以上，无毒、沸点低、易挥发和浓集，稳定性好[11]。其主要优点是操作装置简单，容易掌握，应用广泛，成本低廉。其主要缺点是费时费力，易乳化，有机溶剂耗费量大，易对环境和实验人员造成污染和伤害。

董维冲等[12]将全血样本经乙醚两步萃取后，采用RP-HPLC分析人全血中环孢素A的浓度。结果，全血中环孢素A的线性范围为0.0101～5.030 μg·mL-1时线性关系良好(r=0.9996)，检测限为4.02 ng·mL-1，方法回收率为96.0%～106%，平均提取回收率为74.4%～77.5%，批内、批间的RSD不大于6.0%。该方法灵敏、准确、精密，适宜于临床上环孢素A血药浓度的监测。Guo等[13]采用10%NaOH沉淀全血和尿液中的蛋白后，以1-氯丁烷溶液萃取目标药物，再通过气相色谱-质谱法测定人全血和尿液中4种苯丙胺类毒性药物，结果表明，当目标物浓度在0.02～25 μg·mL-1时线性关系良好(r>0.99)，4种目标物的检出限均为0.005 μg·mL-1，定量限为0.02 μg·mL-1，全血中提取回收率为55.5%～80.5%，尿液中提取回收率为64.6%～86.7%。全血样品日间和日内RSD分别小于12.1%和10.2%，尿液样品日间和日内RSD分别小于11.4%和3.9%。Park等[14]采用盐酸水溶液和甲基叔丁基醚低温超声液液萃取大鼠全血中的免疫抑制剂他克莫司，并结合LC-MS/MS对其进行分析测定。方法在1～200 ng/mL时线性关系良好(r2>0.996)，定量下限为1 ng/mL，日间和日内相对标准偏差小于10.3%，回收率为94.7%～102.6%，该方法成功应用于大鼠全血中他克莫司的药代动力学研究。

1.3超临界流体萃取

超临界流体萃取技术[15](supercritical fluid extraction，SFE)是利用超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下，从样品中萃取目标成分，当恢复到常压和常温时，溶解在超临界流体中的目标成分立即与气态的超临界流体分开，从而达到样品提取和分离的目的。目前，CO2是最常用的超临界流体。它具有无毒、无臭、化学惰性、不污染样品、易于提纯、超临界条件温和等特点，并且可以通过控制其密度而具有很多传统的有机溶剂的萃取能力。其主要优点是在线联用自动化程度高、定量准确快速、回收率高、灵敏度高。其主要缺点是设备装置较为复杂，需使用液态CO2，其应用受到一定限制。

Aty等[16]将超临界流体萃取技术作为样品前处理方法，联合高效液相色谱荧光检测，对血浆和牛奶中的奥比沙星进行了分析测定，这是超临界流体萃取技术首次应用于生物样品中抗生素的萃取。在最优萃取和分析条件下，浓度范围在0.01～0.2 μg/mL之间时线性关系良好(r2≥0.999)，回收率74.2%～127.73%，血浆和牛奶的检出限分别为0.004 μg/mL 和0.006 μg/mL，定量限分别为0.01 μg/mL和0.02 μg/mL。该方法成功用于哺乳期服用奥比沙星的药代动力学参数研究。Matsubara等[17]将超临界流体萃取技术与液相色谱串联质谱法结合，测定了干血清斑中靶向脂质体(磷脂，脂肪酸，酰基肉碱，胆汁酸等)和亲水性化合物(氨基酸，胺类，核酸等)等相关代谢物200种，其中超过160种代谢产物稳定性良好，RSD<20%，研究结果表明，CO2气体的加入改善了疏水性代谢产物的萃取效率。Rezaei等[18]建立了超临界流体萃取，随后超分子纳米溶液萃取全血中左炔诺孕酮和醋酸甲地孕酮的方法，并结合高效液相色谱紫外检测对其进行测定，其线性范围为0.5～7.0 mg·kg-1，检出限分别为0.2 mg·kg-1和0.1 mg·kg-1。

1.4微透析

微透析(microdialysis，MD)是基于“膜分离”原理的一项技术，兼“采样”与“前处理”于一体，所采样品可直接进样分析。MD系统一般由探针、连接器、收集器、灌流液和微量注射泵组成。同时，微透析常与高灵敏度分析系统在线联用，实现从样品的采集、处理到分析完全自动化[19]。MD主要用于药动学和药效学研究，可在线连续监测体内体液药物浓度变化以及靶部位药物浓度变化。其主要优点是在不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样，采集与分析过程既可离线也可在线检测。其主要缺点是采集对象的局限性，探针重复使用性差，成本高。

彭珑等[20]建立了微透析技术联合高效液相色谱-质谱串联法(HPLC-MS/MS)，监测感染靶部位美罗培南的血药浓度的方法。为美罗培南的药动/药效学研究奠定基础。结果，美罗培南在0.01～40 μg/mL线性范围内线性关系良好(r=0.9979)，日内及日间精密度在9.76%以内，准确度-7.87%～0.28%。该方法灵敏度高、专属性强、精密度好、准确度高，适用于微透析样品的快速有效分析。Pigatto等[21]应用微透析法联合HPLC-UV，定量分析大鼠血浆及肿瘤组织液中的依托泊苷，用于药代动力学研究，线性范围为10～1500 ng·mL-1。该方法为依托泊苷的药代动力学及药效学参数设置提供了理论依据。Mao等[22]建立了一种简单、快速、同时测定大鼠血液中尼古丁及其9种代谢产物的方法，实验采用体内微透析采样技术联合超高液相色谱-串联质谱法，对尼古丁及其代谢产物进行了定量及定性分析。目标物定量限为0.039～0.46 ng/mL，日间和日内精密度均小于11%。该方法为尼古丁的药动学参数设置提供了理论基础。

1.5固相萃取法

固相萃取(solid phase extraction，SPE)是液固萃取和液相色谱柱技术相结合的产物[23]。其基本原理是利用固体吸附剂对液体样品中目标物质的吸附，选用合适强度的洗脱溶剂，使目标化合物选择性地洗脱或保留在柱上，与样品基体和干扰物分离，从而达到分离和富集的目的[24-25]。

固相萃取主要分为4个步骤：固相萃取柱的活化、样品添加、柱洗涤和分析物的洗脱。一般先用极性有机溶剂(如甲醇等)对固相萃取柱进行活化，以去除填料中可能存在的其他杂质，从而使填料溶剂化，以便样本与固相表面发生作用,然后将待测样品添加于固相萃取柱中,用正压或负压使样品保持一定的流速通过固相萃取柱，再用适当的洗涤剂选择性地洗去杂质而分析物保留在固相萃取柱上,最后选取合适的洗脱剂选择性地将分析物洗脱下来，接入仪器进行分析[26]。其主要优点是操作简便、有机溶剂用量少、提取速度快、回收率高、富集净化效果好、易与现代分析仪器联用。其主要缺点是商品化的固相萃取吸附剂难以重复使用，成本较高。

李鹏等[27]采用凝胶渗透色谱-硅胶/氧化铝复合固相萃取柱对人血清样本进行净化，使用气相色谱-质谱联用仪测定人血清中7种磷酸三酯类化合物，此前处理方法不仅对磷酸三酯类化合物的结构无破坏，而且可有效去除血清样本中的蛋白质和脂肪等基质干扰，7种目标化合物的回收率均大于75%。Zare等[28]发展一种基于Fe3O4@ZrO2@十六烷基吡啶纳米粒子为吸附层的表面活性剂分子的新型磁性固相萃取，结合HPLC-UV，测定血浆中抗抑郁药阿米替林和去甲替林。其前处理过程为先通过甲醇破坏蛋白以释放与血浆蛋白结合的药物，再通过丙酮沉淀血浆蛋白，最后经过磁性固相萃取分离富集目标化合物。该方法对阿米替林和去甲替林的富集倍数为220和250，检出限分别为0.04 ng·mL-1和0.08 ng·mL-1，相对回收率89%～105%，相对标准偏差小于4%。Alexandros等[29]采用甲醇沉淀蛋白，涡旋离心取上清液，上清液经Sigma-Aldrich公司的杂化固相萃取小柱萃取的前处理方法，结合液相色谱-串联质谱法，测定血清中双酚A、辛基酚、壬基酚的含量。双酚A、辛基酚和壬基酚的检出限分别为0.8 ng/mL、1.3 ng/mL和1.4 ng/mL，定量限分别为2.7 ng/mL、4.2 ng/mL和4.7 ng/mL。双酚A、辛基酚和壬基酚的绝对回收率分别为62.7%～75%和59%～85%、59%～64.3%，相对标准偏差分别小于14.3%、10.9%和13.5%。

2　展　望

近年来，血药浓度分析的前处理方法不断发展，一些新技术、新萃取材料的出现促进并丰富了血液样品的前处理技术，使得血液样品前处理技术向操作简便，所需样品和试剂消耗微量化，目标物富集效率高，杂质去除能力强，与分析仪器联用更加便捷的方向发展。因此，发展新型血液样品前处理方法和萃取材料，进一步拓展其在生物医学研究中的应用范围将是今后重要的研究方向。

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Pretreatment Method for Analysis of Drug Concentration in Blood and Its Application*

ZHANG Qian-ying,WANG Xue-sheng,HOU Ning

(School of Public Health,North China University of Science and Technology,Hebei Tangshan 063000,China)

Pretreatment of the blood sample is the focus and difficulty in the whole process for analysis of drug concentration in blood,is the main source of error analysis,so a suitable pretreatment method directly affects the speed,sensitivity,accuracy of analysis and the life of analytical instruments.The recent development of the pretreatment methods and applications of analysis for drug concentration in blood were reviewed,with emphasis on protein precipitation,liquid-liquid extraction,supercritical fluid extraction,microdialysis and solid phase extraction.

analysis of drug concentration in blood; pretreatment method; application

河北省自然科学基金项目(No:B2013209238)。

张倩影(1986-)，女，在读硕士研究生。

王学生(1964-)，男，教授，主要从事食品中外源性污染物分析。

O658.2

A

1001-9677(2016)011-0010-04