新型齐墩果酸烟酸衍生物的合成及其活性研究*

燕志卫，张丽颖

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北　承德　067000)



新型齐墩果酸烟酸衍生物的合成及其活性研究*

燕志卫，张丽颖

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德067000)

以五环三萜化合物齐墩果酸以及烟酸为原料，经取代、酯化、酰化、还原等反应合成了2个新型齐墩果酸烟酸衍生物，并对两个化合物进行了糖原磷酸化酶抑制活性测试。结果表明两个化合物均显示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性。此外，实验过程中，对齐墩果酸苄酯的酯化反应进行了优化。中间体及目标产物的结构均经NMR、IR和MS确证。

齐墩果酸；合成；烟酸；糖原磷酸化酶抑制剂

糖尿病是一种常见多发的慢性代谢性疾病，其临床表现主要为高血糖和糖尿。持续的高血糖会导致许多并发症的发生，特别是高脂血症是导致脂肪肝、动脉粥样硬化等的重要危险因素，严重威胁人们的健康和生命[1]。过去认为，糖尿病脂代谢异常是继发于糖代谢的紊乱，但在2001 年ADA大会上,得到了重新认识，糖尿病不仅仅是高血糖的问题。McGarry提出了脂代谢异常是2型糖尿病及其并发症的原发性病理生理过程，糖尿病可称为糖脂病 (diabetesmellipidus)[2]。

国际上目前对糖尿病合并脂代谢紊乱尚无良好的根治药物，治疗多以西药为主，但存在低血糖症、胃肠道反应等副作用，同时随着治疗时间的延长，降糖效果呈降低趋势。因此，寻找抗糖尿病新药，特别是从天然中草药中筛选有效、安全、方便使用的降糖药物，日益为世界各国医药工作者所关注，成为当前研究的热点。

齐墩果酸是中药青叶胆全草或女贞子的果实中分离得到的一种五环三萜化合物，已被证实具有显著的降血糖活性，可作为潜在的降糖药物[3-6]。但由于齐墩果酸的水溶性较差、活性较弱、且对糖尿病高血脂并发症无显著作用，使其临床应用受到限制。烟酸具有较好的水溶性，临床上常用于调节血脂异常。但是，由于烟酸游离羧基的存在，会导致用药者出现面部潮红、瘙痒、胃肠道不适等副作用[7]。因此，我们综合利用齐墩果酸和烟酸各自的特点，应用拼合原理，合成齐墩果酸烟酸衍生物。以期获得水溶性增加、生物利用度高、具有协同降糖降脂类新药，以便工业化生产和临床应用。

图1　齐墩果酸烟酸衍生物的合成路线

1　实　验

1.1仪器与试剂

AVANCE-300MHz型核磁共振仪，德国Bruker；SHIMADZU FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker；HP1100LC/MSD，美国PE；maXis impact-HRMS，德国Bruker；RY-1熔点仪，天津市分析仪器厂；酶标仪，美国BIO-RAD公司；数显示水浴锅，国华电器有限公司；电热鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；台式离心机，上海手术器械厂；高压灭菌锅，上海医用核子仪器厂；752分光光度计；96孔板，美国COSTAR公司。

糖原磷酸化酶、葡萄糖-1-磷酸、糖原、孔雀绿，美国SIGMA公司；咖啡因，上海试剂二厂；Hepes、EGTA、EDTA，南京生兴生物技术有限公司；四水合钼酸铵，合肥工业大学化学试剂厂。其余试剂均为化学纯或分析纯试剂。

1.2合成实验

1.2.1烟酸-2-丙炔酯(3)

将烟酸(0.39 g,3.16 mmol)和K2CO3(0.87 g,6.32 mmol)置于无水DMF(10mL)中，缓慢加入溴丙炔(0.42 g,3.48 mmol)，室温搅拌过夜。过滤除去碳酸钾，母液倾倒入水中，乙酸乙酯萃取，依次以1 N盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，蒸去溶剂得到壬酸丙炔酯粗品，此粗品无需纯化可直接用于下一步反应。

1.2.23β-羟基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(4)

将齐墩果酸(100 g，0.22 mol)和K2CO3(61 g,0.44 mol)置于DMF(800mL) 中，在50～55℃下于20 min内滴加氯苄(33mL,0.29 mol)，滴毕维持此温度搅拌4 h。将反应混合物冷至室温后过滤，滤饼以DMF (50mL×3)洗涤，得到的母液倾入倒入冰水(3000mL)中，边倒边搅拌使析出的固体分散，静置使固体颗粒变大(必要时可向其中加入食盐并用冰水浴冷却)，抽滤收集固体，以水充分洗涤。干燥后得白色的齐墩果酸芐酯(115 g,96%)。产品无需进一步纯化可直接用于下一步反应。分析用纯品经快速硅胶柱层析制得。m.p.190～192℃。IR(KBr,cm-1):3354,2943,2865,1724,1461,1386,1261,1158,1122,1030,749,696。1H-NMR(300 MHz,CDCl3):0.62,0.78,0.88,0.90,0.92,0.98,1.13 (each 3H,s),2.91 (1H,dd,J=4.4,13.9),3.20 (1H,dd,J=4.5,11.2),5.06 (1H,d,J=12.5),5.08 (1H,d,J=12.5),5.28 (1H,t,J=3.6),7.33 (5H,m)。ESI-MS:569[M+Na]+。

1.2.33β-氯乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(5)

方法一：将齐墩果酸苄酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于吡啶(50mL)，缓慢加入氯乙酸酐10.9mL，室温搅拌过夜。减压蒸去吡啶，残留物以乙酸乙酯溶解后依次以1 N盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，无水硫酸钠干燥。除去干燥剂，母液蒸去溶剂后快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=200/1，V/V)得白色固体(0.26 g,46%)。m.p.174～176℃。IR(KBr,cm-1):2947,2876,1727,1462。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.61,0.87,0.88,0.90,0.91,0.92,1.12 (each 3H,s),2.92 (1H,dd,J=4.2,14.1 Hz),4.04 (2H,s),4.57(1H,t),5.04 (1H,d,J=12.3 Hz),5.10 (1H,d,J=12.3 Hz),5.28 (1H,t),7.29-7.36 (5H,m)。ESI-MS:645.2[M+Na]+。

方法二：将齐墩果酸苄酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于干燥二氯甲烷(10mL)中,加入三乙胺 (0.55mL,3.7 mmol)，冷却至0℃。冰浴下，将氯乙酰氯(0.32mL,3.7 mmol)于30 min内缓慢滴加至此溶液中，然后室温搅拌24 h。减压蒸除溶剂，残余物用乙酸乙酯稀释，然后依次以饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸去溶剂。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=200/1,V/V)，得淡黄色固体(0.32 g,55%)。

方法三：将齐墩果酸苄酯(0.5 g,0.92 mmol)溶于干燥的CH2Cl2(10mL)中,加入K2CO3(0.25 g,1.84 mmol)和催化量的DMAP，冷却至0℃。将氯乙酰氯(0.32 g,2.76 mmol)于30 min内缓慢滴加至此溶液中，然后室温搅拌24 h。过滤，减压蒸除溶剂，残渣用乙酸乙酯稀释，以饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后蒸去溶剂。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=200/1,V/V)，得白色固体(0.5 g，89%)。

1.2.43β-叠氮乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(6)

将3β-氯乙酰基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(0.18 g,0.29 mmol)溶于DMF(8mL)中,加入NaN3(0.11 g,0.45 mmol)，然后在75℃下搅拌3.5 h。反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，有机相以饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=50:1,V/V)，得白色固体(0.17 g,92%)。m.p.135～137℃。IR(KBr,cm-1):2947,2876,2106,1730,1462。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.61,0.88,0.89,0.90,0.92,1.13,1.55 (each 3H,s),2.90 (1H,dd,J=4.3,13.8 Hz),3.85 (2H,s),4.61 (1H,t),5.04 (1H,d,J=12.6 Hz),5.09 (1H,d,J=12.6 Hz),5.29 (1H,t),7.29～7.36 (5H,m)。ESI-MS:652.3[M+Na]+。

1.2.53β-[4-烟酰氧甲基-(1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(7)

将3β-叠氮乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(0.2 g,0.32 mmol)和烟酸-2-丙炔基酯(51 mg,0.32 mmol)溶于CH2Cl2(1.5mL)和H2O (1.5mL)的混合溶剂中，加入CuSO4。5H2O (28 mg,0.11 mmol)和Vc-Na (45 mg,0.23 mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残渣以乙酸乙酯稀释，水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩，快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=5:1,V/V)分离，得到白色固体(0.21 g,83%)。m.p.130～132℃。IR(KBr,cm-1):2947,1728,1463,1279。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.52,0.61,0.73,0.78,0.82,0.84,1.04 (each 3H,s),2.83 (1H,d,J=9.93 Hz),4.46～4.52 (1H,m),4.99 (2H,dd,J=12.5,16.8 Hz),5.09 (2H,s),5.20 (1H,t),5.46 (2H,s),7.26 (5H,m),7.30～7.34 (1H,m),7.76 (1H,s),8.23 (1H,d,J=7.98 Hz),8.71 (1H,d,J=3.54 Hz),9.15 (1H,s)。13C-NMR (75 MHz):177.4; 165.7; 153.3; 150.8; 143.8; 142.8; 137.5; 136.5; 128.4; 128.0; 127.9; 125.5; 123.4; 122.3; 84.0; 65.9; 58.4; 55.2; 51.2; 47.5; 46.7; 45.9; 41.7; 41.4; 39.3; 38.0; 37.7; 36.8; 33.9; 33.1; 32.6; 32.4; 30.7; 28.1; 27.6; 25.8; 23.6; 23.4; 23.1; 18.1; 16.9; 16.5; 15.3。ESI-MS:829.0[M+K]+。

1.2.63β-[4-烟酰氧甲基-(1-氢-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸(8)

将3β-棕榈酰基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(180 mg,0.23 mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入催化量的10%Pd/C，室温常压氢化24 h。常压过滤除去Pd/C，滤液蒸干得到粘稠状液体。柱层析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,V/V)分离，得到白色固体(0.16 g,89%)。m.p.187～189℃.IR(KBr,cm-1):2945,2873,1740,1691。1H-NMR (300 MHz,CDCl3):0.65,0.69,0.75,0.84,0.85,0.86,1.06 (each 3H,s),2.17 (1H,d,J=15.9 Hz),2.75 (1H,d,J=10.2 Hz),4.01 (2H,s),4.47～4.52 (1H,m),4.99 (2H,s),5.20 (3H,s),7.32～7.45 (4H,m),7.70～7.87 (3H,m)。13C-NMR (75 MHz):183.0; 171.4; 165.7; 143.7; 143.2; 133.9; 132.1; 130.2; 128.7; 128.2; 128.1; 126.4; 125.8; 125.5; 125.1; 123.7; 122.4; 83.9; 58.1; 55.2; 51.1; 47.6; 46.5; 45.9; 41.6; 41.0; 39.3; 38.9; 38.0; 37.8; 37.0; 33.8; 33.0; 32.5; 32.5; 30.7; 28.1; 27.7; 25.9; 23.6; 23.4; 22.9; 18.2; 17.1; 16.5; 15.3。ESI-MS:764.7[M+H]+。

1.3化合物对糖原磷酸化酶的抑制活性测试

参照文献方法[8]，对本文合成的2个目标化合物，以咖啡因为阳性对照，进行了抑制兔肌肉糖原磷酸化酶(RMGPa)活性测试。操作流程如下：在微孔板中加入反应缓冲液，加入待测化合物及RMGPa，室温温孵20 min，加入显色液(钼酸铵和孔雀绿)，用BIORAD多功能酶标仪测定(检测波长：655 nm)。

2　结果与讨论

2.1关于合成中涉及到齐墩果酸苄酯的酯化反应方法的讨论

羟基的酯化通常是一种简单的反应，但齐墩果酸苄酯结构钢性，位阻大，羟基活性差，酯化反应较难进行，尤其是与酸的直接酯化非常困难。所以我们尝试了多种方法进行齐墩果酸苄酯3位羟基的酯化：首先采用酸酐法，以吡啶既做碱又做溶剂，反应结果不理想，产率很低。改用CH2Cl2为溶剂，三乙胺为除酸剂，结果虽有所改善，但仍不理想，副产物较多，延长反应时间有利于提高收率，但通过实验研究发现，延长反应时间也会增加副产物的种类和含量。因此，本文采用CH2Cl2为溶剂，K2CO3作除酸剂，DMAP为催化剂，既提高了收率，也缩短了反应历程，后处理简单。

2.2糖原磷酸化酶抑制活性结果与讨论

本文测定了2个新化合物对RMGPa的抑制活性，结果见表1。

表1　化合物7～8对糖原磷酸化酶的抑制活性

a每个结果都是三组实验的平均值；b以咖啡因为阳性对照。

表1结果显示：所合成的齐墩果酸烟酸衍生物显示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性，但是化合物均低优于其先导化合物齐墩果酸 (IC50=66μM)。受化合物数量所限，未得出明显的构效关系，深入的构效关系尚待进一步研究。

3　结　论

以齐墩果酸及烟酸为母核，应用拼合原理共合成4个中间体化合物以及2个新的未见文献报道的齐墩果酸烟酸衍生物，对实验中涉及到的齐墩果酸苄酯的酯化反应方法进行了摸索及讨论，提高了产率。对所合成的2个目标化合物进行了糖原磷酸化酶抑制活性测试。活性测试结果显示2个目标化合物均显示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性。

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Study on the Conjugates of Oleanolic Acid-nicotinic Acid as Glycogen Phosphorylase Inhibitor*

YAN Zhi-wei,ZHANG Li-ying

(Key Laboratory of Research and Exploiture for New Drugs of Chinese Materia Medicine,Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Hebei Chengde 067000,China)

Two novel conjugates of oleanolic acid-nicotinic acid were synthesized by alkyl substitution,esterification,acylation and reduction reactions,etc.The results indicated that two derivatives exhibited some activities against glycogen phosphorylase.In addition,the esterification reaction at C-3 position of oleanolic acid benzyl ester was optimized during the experimental process.The structure of intermediates and target product were identified by IR,NMR and MS.

oleanolic acid; synthesis; nicotinic acid; glycogen phosphorylase

河北省教育厅资助项目(No.Y2012026)。

张丽颖(1981-)，女，副教授，主要从事药物设计与合成研究。

R914.5

A

1001-9677(2016)011-0062-03