肉桂、丁香、连翘挥发油联合抑菌作用研究*

黄涵年，阙　斐

(浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江　杭州　310018)



肉桂、丁香、连翘挥发油联合抑菌作用研究*

黄涵年，阙斐

(浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江杭州310018)

水蒸气蒸馏提取肉桂、丁香、连翘三种香辛料挥发油，测定与评价三种挥发油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最低抑菌浓度(MIC)以及挥发油两两复配联用的抑菌活性。结果显示，供试菌对三种挥发油均高度敏感，且存在剂量效应，随着挥发油浓度的降低而降低。另外，肉桂(增效2倍)和丁香(增效2倍)、肉桂(增效2倍)和连翘(增效4倍)挥发油复配后对大肠杆菌表现出相加作用，对金黄色葡萄球菌表现出协同作用(均增效4倍)；而丁香和连翘挥发油复配后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，则表现出无关作用。

肉桂；丁香；连翘；挥发油；抑菌作用

香辛料具有独特的刺激性香味，广泛应用于烹饪和食品工业中，起着调香、调味、调色等作用。目前，世界上已知香辛料多达500种。美国香辛料协会(American Spice Association)定义，凡是用来做食品调味用的植物，均可称为食用香辛植物，我国国家标准《GB/T 12729.1-2008 香辛料和调味品名称》规定了68种我国常用香辛料植物性产品。另外，香辛料还具有抑菌、抗氧化及多种生理生化作用[1-2]。其中，香辛料的良好抑菌性能已经被诸多研究所证实[3-6]。因此，从香辛料中提取出安全、高效的有效成分作为食品天然抑菌剂，具有广阔的应用前景。

挥发油(Volatile Oils)，又称精油(Essential Oils)或者轻油，是一类具有挥发性和芳香气味、可随水蒸气蒸馏出来的非水溶性油状液体。研究证实，香辛料挥发油有明显的抑菌活性[7-8]。由于香辛料挥发油作为天然防腐剂具有安全、天然、无毒等特点，符合人们对绿色消费、健康生活的追求，已经成为各国研究者的新宠。目前，可用于香辛料挥发油的提取方法有：蒸馏法、溶剂浸提法、吸收法、水扩散法、冷压法、冷冻法、超临界流体萃取法和超声波萃取法等。

本文选择肉桂、丁香、连翘三种香辛料，水蒸气蒸馏提取挥发油，采用滤纸片法、棋盘稀释法对三种香辛料挥发油、挥发油两两混合物联合的抗菌效应分别进行了研究，以期为香辛料挥发油作为天然防腐剂的研究开发提供理论基础。

1　实　验

1.1材料与试剂

肉桂、丁香、连翘购自杭州市江干区药房；大肠杆菌(Escherichia coli)AS1.90；金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)AS1.89，均购自中科院微生物所。

营养琼脂(Nutrient Agar，NA)培养基、营养肉汤(Nutrient Broth，NB)培养基，青岛海博生物技术有限公司；吐温-80(分析纯AR)，美国Sigma公司。本实验所用其余生化试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

水蒸气蒸馏装置；恒温恒湿培养箱(LHS-100CL型)，上海一恒科学仪器有限公司；分析天平(ATL-224-I)，德国艾科勒；压力蒸汽灭菌锅(GI54DWS)，厦门致微仪器有限公司；普通生物显微镜(N-400M)，宁波永新光学股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1水蒸气蒸馏提取

挥发油与水不相混合，因此，含有挥发油的中草药可以利用水蒸气蒸馏法来提取(《中华人民共和国药典》)。分别将肉桂、丁香、连翘三种香辛料进行粉碎，取200 g粉末于三口圆底烧瓶中，加入10倍量(m/V)的蒸馏水，室温浸泡2 h，用电热套加热直至沸腾，调节温度，保持料液沸腾状态提取6 h，待冷凝管上看不到有油滴出现时说明蒸馏彻底。蒸馏提取过程中，注意观察油水分离器中挥发油提取情况，收集挥发油。

1.3.2挥发油脱水处理

将所得产物装入分液漏斗，加入适量石油醚摇匀，进行萃取，取上层。用无水硫酸钠吸收多余水分后，得粗制挥发油。将粗制挥发油转移至蒸馏烧瓶中，45℃真空旋转蒸发，待石油醚蒸发彻底后，得精制香辛料挥发油。取出挥发油，用0.22μM的微孔过滤器进行过滤除菌后，置于已灭菌的棕色样品瓶中，于4℃冰箱中储存备用。

1.3.3药液与菌悬液制备

药液制备。将所得肉桂、丁香、连翘三种挥发油原液，分别用灭菌处理的1.0%吐温-80蒸馏水溶液依此稀释配制成100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%等不同浓度的药液。

菌悬液制备。分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种在营养琼脂上，于37℃培养14 h进行活化，挑取活化的细菌菌落，营养琼脂划线培养24 h，用无菌生理盐水将菌落洗脱下来，充分振荡，采用平板培养计数法测定细菌数量，再制成106～107CFU/mL的菌悬液，备用。

1.3.4肉桂、丁香、连翘挥发油体外抑菌实验

采用滤纸片法。用打孔器制备直径为6 mm圆形滤纸片，灭菌干燥后，分别浸泡于制备的肉桂、丁香、连翘三种挥发油药液(100%、80%、60%、40%、20%、10%)中1 h，晾干备用。制备灭菌营养琼脂平皿，吸取已调整浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液0.1mL，加入营养琼脂平皿。分别取已浸泡三种挥发油的滤纸片贴于平皿上，每皿3片，滤纸片间保持一定的距离。同时以1.0%吐温-80蒸馏水溶液为阴性对照，以蒸馏水为空白对照。(36±1)℃下培养24 h后，用十字交叉法测抑菌圈大小。实验重复 3 次。

1.3.5肉桂、丁香、连翘挥发油最低抑菌浓度(MIC)测定

最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)是指能抑制细菌生长的最低浓度，常被用来比较不同抑菌物质的抑菌性能，是用来判断药物抑菌活性的最重要测定指标[9]。分别取制备的三种挥发油药液(10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%)2mL加入到无菌平皿，倾入55℃左右灭菌营养琼脂18mL，充分混匀(培养基中挥发油浓度为1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.0078%)。待培养基凝固后，吸取菌悬液0.1mL于含不同浓度挥发油的培养基上涂布均匀。取2mL 1.0%吐温-80蒸馏水溶液加入平皿，混匀18mL营养琼脂，涂布0.1mL为阴性对照，同时设置蒸馏水空白对照。(36±1)℃下培养24 h后，以完全无菌生长的最低精油稀释浓度为挥发油对某供试菌的最低抑菌浓度(MIC)。实验重复 3 次。

1.3.6复配联用挥发油的抑菌活性测定与评价

采用棋盘稀释法(Checkerboard Method)，两种供试菌均按照横排5管+纵裂5管排布，试管内加入9mL培养基。用1.0%吐温-80蒸馏水溶液分别将A挥发油和B挥发油稀释成10、5、2.5、1.25、0.625 MIC系列挥发油稀释液。两种挥发油不同浓度各0.5mL混匀，并分别按横排从上至下和纵裂从右往左加入到试管中(图1)，则试管中两种挥发油浓度依此为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125MIC。置于(36±1)℃培养24 h。采用测定MIC的方法对各试管内的菌体生长情况进行检验。以1.0%吐温-80蒸馏水溶液为对照。实验重复3次。

图1　棋盘稀释法示意图

用分级抑制浓度指数(Factional inhibitory concentration indices，FICI)评价两种挥发油联合抑菌效果[10-11]，其计算公式为：

FICI=FICA+FICB=(MICA联合时/MICA单独时)+(MICB联合时/MICB单独时)

FICI的判断标准为：FICI≤0.5，为协同作用;0.52时为拮抗作用。

1.3.7统计学分析

所有数据都以均值的标准误(mean±SEM)表示，所有数据分析使用SPSS 17.0计算，图形由GraphPad Prism 5.0软件处理。

2　结果与讨论

2.1肉桂、丁香、连翘挥发油提取

香辛料植物均含有一定的挥发油，但是不同的香辛料挥发油含量差异较大，颜色也不同，肉桂、丁香、连翘三种挥发油提取结果见表1。

表1　肉桂、丁香、连翘三种挥发油提取结果

其中，肉桂和丁香挥发油均大于1，连翘挥发油密度小于1；丁香挥发油提取得率最高(12.0%～14.0%)，其次为肉桂挥发油提取得率(2.0%～2.5%)，连翘挥发油提取得率最低(1.5%～2.0%)。

香辛料挥发油存在于香辛料植物表皮组织的腺毛、油室、分泌细胞和树脂道中，多数呈油滴状存在，也有些与树脂、粘液质共同存在[12]。使用水蒸气蒸馏法行香辛料挥发油提取，为了提高得率和提取速度，在提取挥发油前对肉桂、丁香、连翘进行粉碎和浸泡处理后，水蒸气蒸馏，收集挥发油。三种香辛料挥发油提取过程可以看出，蒸馏初始时挥发油大量馏出，3 h内90%以上的挥发油已经提取出来，3 h后，料液中油类组分减少，油水比降低，共沸点升高，挥发油馏出量减少(图2)。

图2　肉桂、丁香、连翘挥发油提取率测定

根据抑菌圈实验结果判定标准[13]：抑菌圈直径>15 mm为高度敏感；抑菌圈直径10～15 mm为中度敏感；抑菌圈直径为7～9 mm为低度敏感；抑菌圈直径<7 mm为不敏感；直径越大抗菌活性越强。结果显示，三种香辛料挥发油原液及中、高浓度稀释液(>40%)对供试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)均属于高度敏感。肉桂、丁香、连翘三种挥发油对大肠杆菌的抑菌圈直径测定结果如图3所示：肉桂、丁香、连翘挥发油对大肠杆菌生长的抑制能力均随着浓度的降低而降低，存在剂量效应；各浓度丁香挥发油对大肠杆菌生长的抑菌能力强于肉桂与连翘挥发油抑菌能力。

图3　肉桂、丁香、连翘挥发油对大肠杆菌的抑菌圈直径

2.2肉桂、丁香、连翘挥发油抑菌实验

对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径测定结果如图4所示：肉桂、丁香、连翘挥发油对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力均随着浓度的降低而降低，存在剂量效应；各浓度肉桂挥发油对金黄色葡萄球菌生长的抑菌能力强于丁香与连翘挥发油抑菌能力。

图4　肉桂、丁香、连翘挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

2.3肉桂、丁香、连翘挥发油最低抑菌浓度(MIC)测定结果

肉桂、丁香、连翘三种挥发油最低抑菌浓度(MIC)测定结果如表2所示。

表2　肉桂、丁香、连翘挥发油对供试菌MIC

由表2可以看出，肉桂挥发油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为0.0625%；丁香挥发油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为0.125%；连翘挥发油对大肠杆菌的MIC为0.125%，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.25%。肉桂、丁香、连翘三种挥发油均表现出较强的抑菌作用。

2.4肉桂、丁香、连翘挥发油两两复配抑菌活性测定与评价

肉桂、丁香、连翘三种香辛料挥发油两两复配后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行体外抗菌试验，联合抑菌实验结果见表3。

肉桂挥发油和丁香挥发油复配后对大肠杆菌，MIC联用值均为MIC单用的0.5倍时，两者FICI值最小(=1)，因此，肉桂挥发油和丁香挥发油联合使用后，对大肠杆菌表现出相加作用，增效2倍；对于金黄色葡萄球菌，两者的MIC联用值均为MIC单用的0.25倍时，FICI值最小(=0.5)，表现出协同作用，增效4倍。

肉桂挥发油和连翘挥发油复配后对大肠杆菌，MIC肉桂-联用值为MIC肉桂-单用的0.5倍，MIC连翘-联用值为MIC连翘-单用的0.25倍时，FICI值最小(=0.75)，表现出相加作用，肉桂挥发油增效2倍，连翘挥发油增效4倍；对于金黄色葡萄球菌，两者的MIC联用值均为MIC单用的0.25倍时，FICI值最小(=0.5)，表现出协同作用，均增效4倍。

丁香挥发油和连翘挥发油复配后对大肠杆，MIC丁香-联用值为MIC丁香-单用的0.125倍，MIC连翘-联用值与MIC连翘-单用值相等时，FICI值最小(=1.125)，表现出无关作用；对于金黄色葡萄球菌，同样，当MIC丁香-联用值为MIC丁香-单用的0.125倍，MIC连翘-联用值与MIC连翘-单用值相等时，FICI值最小(=1.125)，表现出无关作用。

表3　肉桂、丁香、连翘挥发油联合抑菌试验与效果评价

3　结　论

本研究采用水蒸气蒸馏提取肉桂、丁香、连翘三种挥发油，滤纸片法、棋盘稀释法测定了三种挥发油单用及两两联用的抑菌作用。结果显示，(1)肉桂、丁香、连翘三种挥发油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制能力较强，且存在剂量效应，均随着浓度的降低而降低；(2)丁香挥发油对大肠杆菌生长的抑菌能力强于肉桂与连翘挥发油，而对于金黄色葡萄球菌，肉桂挥发油的抑菌能力强于丁香与连翘挥发油；(3)肉桂和丁香挥发油复配后对大肠杆菌表现出相加作用，均增效2倍，对金黄色葡萄球菌表现出协同作用，均增效4倍；(4)肉桂和连翘挥发油复配后对大肠杆菌亦表现出相加作用，分别增效2倍与4倍，对金黄色葡萄球菌表现出协同作用增，均增效4倍；(5)丁香和连翘挥发油复配后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，均表现出无关作用。

[1]彭林,李明泽,任文瑾,等.香辛料生理功能的研究进展[J].食品与发酵工业,2012,38(2):157-162.

[2]周凤超,杨庆余,陈洪生.香辛料对提高食品品质及安全性的研究进展[J].沈阳师范大学学报:自然科学版,2015,33(1):60-63.

[3]李京晶,籍保平,周峰,等.丁香和肉桂挥发油的提取、主要成分测定及其抗菌活性研究[J].食品科学,2006,27(8):64-68.

[4]顾仁勇,张石峰,刘莹莹,等.五种香辛料精油抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科学,2008,29(3):106-108.

[5]柴梦颖,焦镭.15种中草药提取液抑真菌活性的研究[J].农产品加工:学刊,2012(5):61-64.

[6]Del C J,Amiot M J,Nguyenthe C.Antimicrobial effect of rosemary extracts.[J].Journal of Food Protection,2000,63(10):1359-1368.

[7]谭龙飞,杨连生,尹亮,等.五香粉两种提取物的防霉抑菌作用研究[J].粮油加工与食品机械,2004(3):49-49.

[9]刁文睿.公丁香油脂的体外抗氧化、抑菌活性及抑菌机理研究[D].山西师范大学,2015.

[10]宫霞,乐国伟,李云飞.家蝇幼虫抗菌肽的抗菌谱及其与抗生素的协同作用研究[J].微生物学报,2005,45(4):516-520.

[11]Shanmugam H,Anil Kumar K,Mukesh D.Synergism between natural products and antibiotics against infectious diseases[J].Phytomedicine International Journal of Phytotherapy& Phytopharmacology,2008,15(15):639-52.

[12]周峰.香辛料精油中抗菌成分分离鉴定、功能协同强化及量化研究[D].北京:中国农业大学,2007.

[13]李春美,杜靖,谢笔钧.柚皮提取物的抑菌作用[J].食品与发酵工业,2004,30(1):38-41.

Study on Combined Antiseptic Effects of Cinnamon,Cloves and Forsythia Suspense Volatile Oils*

HUANG Han-nian,QUE Fei

(Department of Applied Engineering,Zhejiang Economic & Trade Polytechnic,Zhejiang Hangzhou 310018,China)

Spices volatile oils of cinnamon,cloves and forsythia suspense were extracted by steam distillation.The inhibition zone diameters,minimum inhibition concentrations (MICs) and the antimicrobial activities of two volatile oils compound on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were determined and evaluated.The results showed that the tested microorganisms were highly sensitive to three kinds of volatile oils,all with a dose effect.The antimicrobial activities were decreased with the decrease of concentration of the volatile oils.The combined use of cinnamon (2 times efficiency) and cloves volatile oils (2 times efficiency),cinnamon (2 times efficiency) and forsythia suspense (4 times efficiency) volatile oils both had additive effects on Escherichia coli,and synergic effects on Staphylococcus aureus(all 4 times efficiency),and the combined use of cloves and forsythia suspense volatile oils showed indifferent effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus.

cinnamon; cloves; forsythia suspense; volatile oil; antimicrobial activity

浙江经贸职业技术学院2015年院级科研课题(No:15QN02)。

黄涵年(1988-)，男，助教，主要从事农产品与食品微生物检验。

TS201.3

A

1001-9677(2016)011-0095-04