高效液相色谱法测定萹蓄中绿原酸含量*

邓仕任，朱夏敏，王　鑫，王春娇，夏林波

(辽宁中医药大学药学院，辽宁　大连　116600)



分析测试

高效液相色谱法测定萹蓄中绿原酸含量*

邓仕任，朱夏敏，王鑫，王春娇，夏林波

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)

建立了高效液相色谱测定萹蓄药材中绿原酸含量的方法，为萹蓄的合理质量控制提供依据。用伊力特Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μM)，流动相乙腈-水(12:88，V:V)，检测波长325 nm。结果显示绿原酸在0.125～1.25 mg/mL范围内线性关系良好，r=0.9995(n=6)，加样回收率101.0%，RSD=1.62%(n=6)；3批萹蓄药材中绿原酸的含量为0.11～0.19 mg/g。绿原酸为萹蓄药材中的特征活性成分，所建立的含测方法操作简便，结果可靠，可作为萹蓄药材质量控制的指标性成分之一。

萹蓄；绿原酸；高效液相色谱；含量测定

萹蓄为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，始载于《神农本草经》，味苦、性微寒，归膀胱经，具有利尿通淋，杀虫止痒的功效，常用于热淋涩痛，小便赤短，虫积腹痛，皮肤湿疹等症[1]，是一味常用中草药。现代研究表明，萹蓄具有利尿、降压、止血、抑菌、抗氧化和保肝等药理作用，临床上用于治疗泌尿系统疾病、肠道系统疾病及糖尿病等[2]。我们的前期研究表明，萹蓄的乙醇提物对α-葡萄糖苷酶具有较好的体外抑制活性，这可能是其治疗糖尿病的作用机制之一。萹蓄的主要化学成分有黄酮类、酚酸类、苯丙素类、生物碱类、萜类等[3]。目前，对萹蓄的质量控制研究主要集中在黄酮类化合物中[4-5]，尚未见基于酚酸类成分展开的质量控制研究。绿原酸为萹蓄中的特征酚酸类成分，其具有降压、抗菌、保肝、抗病毒、抗氧化等多方面药理活性[6-7]，为萹蓄的药效活性成分之一。本实验拟以绿原酸为指标成分，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，建立萹蓄药材中绿原酸的HPLC分析方法，以期为萹蓄药材的合理质量控制提供相关科学依据。

1　实验仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，美国安捷伦；METTLER AE-240型十万分之一分析天，瑞士梅特勒；FA1004B电子天平，上海精密科学仪器有限公司；KQ-250DB型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

绿原酸对照品，购自中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)，天津市大茂化学试剂厂；水为娃哈哈纯净水。

3批萹蓄药材采集自辽宁鞍山千山地区，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分

2　方法与结果

2.1色谱条件

伊力特Hypersil ODS2色谱柱(4.6×250 mm，4.6μM)；流动相乙腈-水(12:88，V:V)；流速1.0mL/min；检测波长325 nm；柱温40℃，进样量20 μL。

2.2对照品溶液制备及线性关系考察

取绿原酸对照品适量，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，得浓度为0.125 mg/mL的对照品储备液。将该储备液用甲醇逐级稀释，配成浓度分别为0.0125、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 mg/mL的系列对照品溶液。将上述对照品溶液依次注入液相色谱仪，进样量为20 μL。以峰面积为纵坐标，样品浓度(mg/mL)为横坐标，得回归方程为y=3.04×106x+366，绿原酸在0.0125～0.125 mg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.9995，n=6)。

2.3供试品溶液的制备

取萹蓄粉末(过40目筛)约2.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入100mL甲醇浸泡过夜，室温超声提取三次，每次20 min，过滤合并提取液，减压浓缩至干后，以甲醇溶解后转入10mL容量瓶中，定容至刻度，测定前置于4℃保存备用，进样分析前经0.22μM滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4精密度试验

精密称取同一萹蓄药材按2.3项下方法制成供试品溶液，连续进样6次，测得保留时间RSD=0.64%，峰面积RSD=1.27%，表明仪器精密度良好。

2.5稳定性试验

精密称取同一萹蓄药材按2.3项下方法制成供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24小时测定峰面积。平均峰面积为67266，RSD=2.69%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6重复性试验

精密称取同一萹蓄药材6份，按2.3项下方法制成供试品溶液，测得样品中绿原酸含量的平均值为0.11 mg/g，RSD=1.14%，证明本方法重复性良好。

2.7加样回收率试验

取已知绿原酸含量(0.11 mg/g)的药材9份，每份约2.0 g，精密称量，3份为一组，置具塞锥形瓶中，每组精密加入低、中、高浓度绿原酸对照品贮备液，按2.3项下方法制备供试品溶液，结果平均加样回收率101.0%，RSD=1.62%(n=9)。

表1　加样回收率试验

2.8样品含量的测定

分别取不同批次收集的萹蓄药材约2 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，其色谱峰如图1所示，记录下峰面积，代入标准曲线，计算出样品中含有绿原酸的含量，结果如表2所示。

图1　萹蓄药材HPLC图

表2　萹蓄药材中绿原酸含量测定结果

3　讨论与结论

(1)萹蓄萹蓄为一年生草本植物，在播种当年的7-8月生长旺盛时采收，齐地割取全株，晒干或鲜用。其又名萹竹、扁竹蓼、扁猪牙等，《尔雅》郭璞注：萹蓄似小藜，赤茎节，好生道傍，可食，又杀虫。其苦降下行，通利膀胱，苦燥又能杀虫除湿止痒，主要用于淋痛及湿疹，还可治疗蛲虫等寄生虫病。萹蓄在我国各地均产，以河南、四川、吉林等地产量较大。在在对辽宁千山地区的道地辽药进行降糖活性的筛选过程中，我们发现委陵菜具有较强的α-葡萄糖苷酶体外抑制活性，提示其可能对二型糖尿病具有一定的治疗作用。

(2)萹蓄中的化学成分主要有黄酮类、酚酸类、苯丙素类、生物碱类、萜类等、糖类等。目前对萹蓄的含量测定研究多集中在其黄酮类成分上，如有报道[3]以杨梅苷和槲皮苷等八种黄酮作为指标成分进行质量控制。然而，对萹蓄中酚酸类成分的含量研究则相对少见。绿原酸为萹蓄中的一种特征酚酸类成分，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂清除自由基等作用[7]，是许多药材，包括萹蓄的主要有效成分之一研究绿原酸的含量分布，对于萹蓄药材的质量控制具有重要意义。

(3)本文首次采取HPLC法，对3批产自辽宁千山地区的萹蓄药材中的绿原酸进行了含量测定，结果分布在0.11～0.19 mg/g范围内。我们所建立的检测方法简便、稳定、灵敏度高，可为萹蓄药材的质量评价提供科学依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:334.

[2]徐燕,李曼曼,刘增辉,等.萹蓄的化学成分及药理作用研究进展[J].安徽农业大学学报,2012,39(5):812-815.

[3]付庆荣,刘淑娟,王弘,等.RP-HPLC-UV法同时测定萹蓄中8个黄酮类化合物的含量(英文)[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2014,23(03):170-176.

[4]胥秀英,郑一敏,傅善权,等.高效液相色谱法测定萹蓄中金丝桃苷等3种有效成分的含量[J].时珍国医国药,2006,17(4):563-564.

[5]陈娟,师彦平.HPLC测定萹蓄中槲皮素和山柰素的含量[J].中国中药杂志,2009,34(4):423-427．

[6]吴卫华,康桢,欧阳冬生,等.绿原酸的药理学研究进展[J].天然产物研究与开发,2006(04):691-694.

[7]陈绍华,王亚琴,罗立新.天然产物绿原酸的研究进展[J].食品科技,2008,33(02):195-199.

HPLC Method for Determination of Chlorogenic Acid in Polygonum aviculare L.*

DENG Shi-ren,ZHU Xia-min,WANG Xin,WANG Chun-jiao,XIA Lin-bo

(College of Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Dalian 116600,China)

An HPLC method for determination of chlorogenic acid in Polygonum aviculare L.was developed,to provide a quality control method for Polygonum aviculare L.The chromatography was carried out on an Elite Hypersil ODS2 column (4.6×250 mm,5μM) with acetonitrile-water (12:88,V:V) as the mobile phase,the detection wavelength was set at 325 nm.Chlorogenic acid could be successfully determined and the linear rang was 0.125～1.25 mg/mL (r=0.9995).The average recoveries(n=6) of the chlorogenic acid was 101.0%，RSD=1.62%.The content of chlorogenic acid in 3 batches was 0.11～0.19 mg/g.Chlorogenic acid was the specific ingredient in Polygonum aviculare L.The method is accurate,reliable and sensitive for quality control of Polygonum aviculare L.

Polygonum aviculare L.; chlorogenic acid; HPLC; determination

国家自然科学基金项目(81202857)；辽宁省自然科学基金(2015020713)；辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJQ2015070)。

邓仕任(1979-)，男，博士，副教授。

夏林波(1977-)，女，博士，副教授，研究方向为中药分析。

R284.1

A

1001-9677(2016)011-0152-02