恩诺沙星纳米乳的体外抗菌活性及治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的效果观察

杨雪峰,柳东阳,王自良,齐永华,韩庆功,孙亚伟(河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003)

恩诺沙星纳米乳的体外抗菌活性及治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的效果观察

杨雪峰,柳东阳,王自良,齐永华,韩庆功,孙亚伟
(河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003)

利用试管二倍稀释法研究了恩诺沙星纳米乳的体外抗菌活性,并对恩诺沙星纳米乳治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的效果进行了观察.结果表明,恩诺沙星纳米乳对标准菌株的抗菌活性为恩诺沙星原料药的2倍,是其常规制剂抗菌活性的2～8倍;对临床分离菌株的抗菌活性是其常规制剂的4～8倍;恩诺沙星纳米乳对仔猪大肠杆菌性腹泻的治愈率为93.3%,说明恩诺沙星纳米乳具有较强的体外抗菌活性,且对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗效果较好.

恩诺沙星;纳米乳;最小抑菌浓度;腹泻

恩诺沙星是第一个被批准允许使用的喹诺酮类动物专用抗菌药[1],为广谱杀菌药,在兽医临床中应用非常广泛,主要用于治疗各种动物由革兰阴性菌和革兰阳性菌引起的消化、呼吸和泌尿系统等感染,但水溶性差一直是影响恩诺沙星制剂发展和临床应用的一个关键因素.为此,杨雪峰等利用纳米乳作为药物载体,研制出一种恩诺沙星纳米乳[2-3],并就其制备方法申请了国家发明专利.本试验初步研究了恩诺沙星纳米乳的体外抗菌活性及临床治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的效果,以期为其在兽医临床中的推广应用提供参考.

1　材料与方法

1.1标准菌株大肠杆菌ATCC25922(批号:44113-10)和金黄色葡萄球菌ATCC25923(批号:26112-8),均购自中国药品生物制品检定所.

1.2临床分离菌株3种主要病原菌的临床分离株:金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌,均由河南科技学院微生物教研室提供.

1.3实验动物通过临床诊断和实验室检验确诊为大肠杆菌性腹泻的仔猪(35±2)日龄,60头.

1.4试验药品恩诺沙星原料药,郑州凡盛生物技术有限公司,批号20090930;恩诺沙星纳米乳,参照文献[2-3]制备;恩诺沙星注射液,吉林省五星动物保健药厂,批号20100201;恩诺沙星可溶性粉剂,河南伯乐兽药有限公司,批号20100712;恩诺沙星混悬液,参照文献[4]制备.

1.5方法

1.5.1体外抗菌活性测定最小抑菌浓度(MIC)的测定:采用试管二倍稀释法[5],用pH值6.0的PBS无菌配制各抗菌药物原液,使其浓度为1 280 μg/mL.然后将浊度为9.0X108个CFU/mL的菌液用MHB培养液做1∶10 000稀释,除第1管加入1.8 mL稀释后的菌液外,其余各管均加1 mL.在第1管内加入0.2 mL抗菌药物原液,混合后吸取1 m L加入第2管中,同法依次稀释至倒数第3管,弃去1 mL,倒数第2管为生长对照管(阳性对照管,即只加菌液不加药液),倒数第1管为抗菌药物原液和MHB培养液的混合物(阴性对照管).上述各管37℃培养24 h后观察结果,以无细菌生长的最低浓度为MIC.重复5次,取众数为MIC值[6].

最小杀菌浓度(MBC)的测定:将MIC浓度以上的试管接种于不含药物的MHA培养基平板上,继续培养24 h,以菌落数不超过5个的培养基的最低药物浓度为该药物的MBC.重复5次,取众数为MBC值[6].

1.5.2恩诺沙星纳米乳治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的效果观察试验分组:试验分为4组:恩诺沙星纳米乳组(以恩诺沙星计,5 mg/kg体重)、恩诺沙星可溶性粉剂组(以恩诺沙星计,5 mg/kg体重)、感染对照组(感染猪不投药)和正常对照组(健康猪).每组15头猪.

恩诺沙星纳米乳和可溶性粉剂均用水配制成相同浓度的溶液,然后按每公斤体重5 mg,每日早晚各1次灌服给药的方式,连续给药5 d.治疗期间,每天早晚两次观察各组猪的精神状态、食欲、大便状况、肛门红肿情况及肛周的干湿度等临床症状,并记录死亡情况.

疗效判定:(1)治愈率:猪的精神状态、食欲、粪便完全恢复正常.试验结束时计算治愈率; (2)有效率:完全治愈的猪和试验猪的精神、食欲明显好转,拉稀次数明显减少,或临床症状缓解的均为有效.试验结束时计算有效率;(3)死亡率:试验结束时计算各组的死亡率.

数据处理:试验数据经SPSS 11.5统计软件处理,采用χ2检验差异显著性.

2　结果与分析

2.1恩诺沙星纳米乳对标准菌株的MIC和MBC见表1.

表1　恩诺沙星纳米乳对标准菌株的MIC和MBC (μg/m L)

由表1可知,恩诺沙星纳米乳液对标准菌株的抗菌活性均为恩诺沙星原料药的2倍,是其常规制剂抗菌活性的2～8倍.结果表明,纳米化处理增强了恩诺沙星原料药的抗菌活性,与其常规制剂相比,恩诺沙星纳米乳具有较强的抗菌作用.

2.2恩诺沙星纳米乳对临床分离菌株的MIC和MBC见表2.

由表2可知,恩诺沙星纳米乳对临床分离菌株的MIC是其常规制剂的1/4～1/8倍,MBC是常规制剂的1/4～1/16倍.结果表明,恩诺沙星纳米乳对临床分离菌株具有较强的抗菌活性.

2.3恩诺沙星纳米乳治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的临床效果见表3.

表2　恩诺沙星纳米乳对临床分离菌株的MIC和MBC (μg/mL)

表3　恩诺沙星纳米乳对仔猪大肠杆菌性腹泻的临床治疗试验

经恩诺沙星纳米乳灌服给药治疗1 d后,试验猪的临床症状明显缓解;2 d后猪只临床症状明显减轻,食欲逐渐恢复正常;3 d后即恢复正常.经恩诺沙星可溶性粉剂治疗的仔猪上述临床好转症状推后0.5～2 d,治愈仔猪灌服给药5 d恢复正常.在感染对照组,猪只腹泻严重,死亡率高达46.7%,耐过仔猪生长缓慢,有成为僵猪的趋势.统计学分析表明,恩诺沙星纳米乳组与可溶性粉剂组对仔猪大肠杆菌性腹泻的治愈率比较,差异显著(P<0.05),见表3.与感染对照组相比,恩诺沙星纳米乳可极显著降低感染仔猪的死亡率(P<0.01).

3　讨论

近年来,兽药制剂已由粉剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、片剂、预混剂等常规剂型转向缓释、控释、靶向等新型制剂方向发展.目前,纳米乳已成为人用药物药剂学领域研究的一个热点,并在多种给药系统中呈现出广阔的发展前景,但其在改造常规兽药方面的研究报道较少.本课题组以纳米乳为药物载体,成功研制出水包油型(O/W)恩诺沙星纳米乳制剂,解决了恩诺沙星水溶性差的问题,并具有制备工艺简单、载药量高、稳定性好、方便群体饮水给药、成本低廉等优点[2].对其体外抗菌活性的研究结果表明,恩诺沙星研制成纳米乳制剂后,对临床常见病原菌的体外抗菌活性强,优于其常规制剂.其抗菌活性较强的原因可能在于恩诺沙星被药物载体包裹后,药物粒径小至纳米级,易于透过细菌的细胞壁,且载药纳米乳的比表面积大,从而增加了菌体内的药物浓度,增强了抗菌作用.关于恩诺沙星纳米乳的确切抗菌机理还有待于深入的研究.

断奶仔猪大肠杆菌性腹泻是由致病性大肠杆菌引起的一种仔猪常见病和多发病,主要表现为肠炎、腹泻、排出白色或黄色稀粪等多种临床症状[7].本病已成为规模化养猪场影响仔猪生长性能的重要疾病之一.尽管控制该病的方法较多,但目前还主要是以敏感性抗菌药物的治疗效果较好.恩诺沙星纳米乳是一种新型抗菌制剂,常见病原菌对其敏感性较常规制剂高,因此其对感染性疾病的治疗效果较好.本试验中,恩诺沙星纳米乳对仔猪大肠杆菌性腹泻的治疗效果好,与可溶性粉剂组比较,差异显著(P<0.05),同时缩短治疗时间0.5～2 d,说明恩诺沙星纳米乳能有效治疗仔猪大肠杆菌性腹泻,缩短治疗时间,减少用药次数,从而提高生产效益.建议临床中应用恩诺沙星纳米乳治疗仔猪大肠杆菌性腹泻病时,按5 mg/kg体重剂量(以恩诺沙星计)灌服给药,连用3～5 d,并可在病情严重时增大给药剂量.

[1]Ribeiro C,Lopes S C,Gameiro P.New insights into the transloca⁃tion route of enrofloxacin and its metalloantibiotics[J].The Journal of Membrane Biology,2011,241(3):117-125.

[2]杨雪峰,齐永华,宁红梅,等.恩诺沙星纳米乳的制备及其质量评价[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2012,38 (6):693-699.

[3]杨雪峰,赵恒章,王自良,等.一种恩诺沙星纳米乳液及其制备方法[P].中国发明专利,CN201010109707.8,20l0-06-23.

[4]吴海坤,方炳虎,时书宁.恩诺沙星混悬液的研制及其在鸡组织中的残留研究[J].动物医学进展,2010,31(4):47-52.

[5]马兴树.禽传染病实验诊断技术[M].北京:化学工业出版社, 2005:108-111.

[6]刘远飞.氟喹诺酮类抗菌药后效应及其机制的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2002.

[7]周德刚,高艳艳,张珍.恩诺沙星注射液对仔猪大肠杆菌性腹泻临床疗效试验[J].中国动物保健,2012,14(7):10-12.

S859.79+6

B

0529-6005(2016)02-0105-02

2014-08-04

河南教育厅科学技术研究重点项目(13A230306);河南科技学院博士科研启动经费项目(09006)

杨雪峰(1973-),女,副教授,博士,研究方向为兽医药理学,E-mail:yangxuefeng2003@126.com