大孔树脂纯化新疆圆柏总黄酮工艺研究

李　倩,奥斯曼江·麦提图尔荪,李晨阳,徐　芳,赵　军,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046;2.新疆医科大学公共卫生学院,新疆乌鲁木齐 830011；3.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆乌鲁木齐 830004)



大孔树脂纯化新疆圆柏总黄酮工艺研究

李倩1,奥斯曼江·麦提图尔荪2,李晨阳3,徐芳3,赵军3,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046;2.新疆医科大学公共卫生学院,新疆乌鲁木齐 830011；3.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆乌鲁木齐 830004)

通过比较D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD417、HPD826六种大孔树脂的静态吸附效果,从中筛选出适合分离新疆圆柏总黄酮的树脂,并在单因素实验基础上正交优化最佳大孔树脂对新疆圆柏总黄酮的纯化工艺。结果表明,D101大孔树脂对新疆圆柏总黄酮具有较好的分离效果;最佳纯化工艺条件为,上样浓度1.2256 mg/mL,上样流速1.0 mL/min,除杂用水量5 BV,乙醇浓度50%,洗脱剂用量4 BV,洗脱流速1.0 mL/min。在此条件下获得总黄酮回收率为88.36%,纯度为69.96%。

新疆圆柏,总黄酮,大孔树脂,纯化

新疆圆柏(Juniperus sabina L.)为柏科圆柏属植物,又称叉子圆柏、爬柏、臭柏、沙地柏等,广泛分布于我国新疆、甘肃、内蒙古和陕北的干旱荒山和沙地之中[1]。该植物的药用部位为嫩枝叶和果实,味微辛辣而稍苦,气辛香,在维吾尔医临床中用于风寒头痛、风湿性关节炎等疑难病症的治疗[2]。圆柏属植物含有双黄酮、木脂素、二萜和倍半萜等多种类型的化合物,黄酮类化合物是其主要的标示性成分[3-5]。近年来已有关于新疆圆柏总黄酮的提取研究[6-7],但对大孔树脂纯化新建圆柏总黄酮的研究未见报道。大孔树脂是一类不溶于酸、碱各种有机溶剂,具有较好吸附性的有机高分子聚合物[8],广泛用于黄酮、多酚等活性物质的分离纯化[9-10]。本文在前期研究基础上,系统地研究了新疆圆柏总黄酮在大孔树脂上的吸附和解吸附规律,确定了新疆圆柏总黄酮的大孔树脂最佳纯化工艺,为其富集纯化和工业化生产提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新疆圆柏2014年9月采自新疆乌鲁木齐南山,由新疆药物研究所何江副研究员鉴定为新疆圆柏Juniperus sabina L.的枝叶,储存于新疆药物研究所标本室。将新疆圆柏枝叶脱脂干燥后粉碎,过50目筛,装于样品袋中备用。

芦丁对照品中国药品生物制品鉴定所(批号10080-200707);大孔吸附树脂(D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD417、HPD826)天津兴南允能高分子技术有限公司;柱层层析硅胶青岛海洋化工厂分厂;其它试剂均为国产分析纯。

AL204电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;752型紫外分光光度计上海科宇实验仪器厂;N-1100旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司;DZTW型调温电热套北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品溶液的制备取新疆圆柏枝叶样品100 g,以料液比1∶25(g/mL)加入50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5 h,过滤,合并滤液,减压浓缩至膏状。然后以适量硅胶拌样后上硅胶柱,分别用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、石油醚-乙酸乙酯(2∶8)、60%乙醇洗脱。收集60%乙醇洗脱液,减压浓缩至无乙醇味后,再用蒸馏水溶解制成样品溶液,待用。

1.2.2标准曲线的绘制准确称取干燥恒重的芦丁标准品0.0100 g,甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中,摇匀,制得芦丁对照品浓度为0.200 mg/mL。精确量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL芦丁对照品溶液分别置于25 mL容量瓶中,分别加入5% NaNO21.0 mL,摇匀,放置6 min后加入10% Al(NO3)31.0 mL,摇匀,放置6 min后加入4%NaOH 10.0 mL,用去离子水定容25 mL,放置10 min后,以相应试剂为空白,于509 nm波长处测定吸光度。以芦丁质量浓度(C,mg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制芦丁标准曲线。

1.2.3大孔吸附树脂型号的筛选称取经预处理的不同型号大孔树脂2.0 g,置于100 mL磨口三角瓶中,加入样品溶液(总黄酮含量为0.8614 mg/mL)30 mL,每隔10 min振摇1 min,持续2 h,然后静置22 h。充分吸附后,测定吸附前后溶液中黄酮的含量,计算吸附量和吸附率。进一步用去离子水洗去残留的黄酮,吸干水分后加入30 mL 70%乙醇,每隔10 min振摇1 min,持续2 h,然后静置22 h。充分解吸后,测定解吸液中新疆圆柏总黄酮的含量,计算解吸率。

式中:C0:吸附前总黄酮浓度,mg/mL;C1:吸附后总黄酮浓度,mg/mL;C2:解吸液中总黄酮浓度,mg/mL;V1:样液体积,mL;V2:解吸液体积,mL;m:树脂的质量,g。

1.2.4大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定称取经预处理的D101树脂10 g,置于500 mL具塞磨口锥形瓶中,加入0.8614 mg/mL样品溶液150 mL,在室温下振摇,按时间点(1、2、3、4、6、8、10、12、24 h)吸取上清液测定总黄酮浓度。以时间为横坐标,吸附率为纵坐标,绘制静态吸附动力学曲线。

1.2.5大孔树脂动态吸附与解吸工艺研究

1.2.5.1上样浓度对吸附量的影响量取D101树脂15 mL,湿法装柱,分别加入浓度为0.6128 mg/mL(160 mL)、1.2256 mg/mL(80 mL)、2.4512 mg/mL(40 mL)、4.9023 mg/mL(20 mL)、9.8046 mg/mL(10 mL)的样品溶液,上样流速2.0 mL/min。上样完成后,用水洗至流出液无色,合并流出液,测定总黄酮浓度,计算吸附量。

1.2.5.2上样流速对吸附量的影响量取D101树脂15 mL,湿法装柱,加入2.4512 mg/mL样液40 mL,调节上样流速分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min。上样完成后,用水洗至流出液无色,合并流出液,测定总黄酮的浓度,计算吸附量。

1.2.5.3最大上样量的确定量取D101树脂15 mL,湿法装柱,加入2.4512 mg/mL样液,上样流速2.0 mL/min;每一个柱体积收集一个流份,测定每一个柱体积中总黄酮的浓度,绘制泄露曲线。

1.2.5.4除杂用水量的确定量取D101树脂15 mL,湿法装柱,以上样流速2.0 mL/min加入浓度为2.4512 mg/mL样液75 mL。上样完成后,用水洗脱,每一个柱体积收集一个流份,将每一个流份浓缩干燥至恒重。

1.2.5.5洗脱剂的选择量取D101树脂15 mL,湿法装柱,以上样流速2.0 mL/min加入浓度为2.4512 mg/mL的样液75 mL。上样完成后,用75 mL水洗,再分别用30%、50%、70%、95%乙醇溶液75 mL以2 mL/min的流速洗脱,收集洗脱液,定容至100 mL,测定总黄酮的含量,计算回收率。然后旋蒸浓缩,干燥,计算纯度。

回收率(%)=(洗脱液总黄酮量/上柱总黄酮量)×100

1.2.5.6洗脱剂用量的确定量取D101树脂15 mL,湿法装柱,以上样流速2.0 mL/min加入浓度为2.4512 mg/mL的样液75 mL。上样完成后,先用75 mL水洗,再用50%乙醇溶液以2 mL/min的流速洗脱,每一个柱体积收集一个流份,测定每一个柱体积中总黄酮的浓度。以柱体积为横坐标,每一个柱体积中黄酮浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线,确定洗脱剂的用量。

1.2.5.7洗脱流速的考察量取D101树脂15 mL,湿法装柱,以上样流速2.0 mL/min加入浓度为2.4512 mg/mL的样液75 mL。上样完成后,用75 mL水洗,再用50%乙醇溶液60 mL分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的流速洗脱,收集洗脱液,定容至100 mL,测定总黄酮的含量,计算回收率。

1.2.6新疆圆柏总黄酮纯化工艺正交实验根据单因素实验结果进行正交实验。量取D101树脂15 mL,湿法装柱(径高比为1∶4),上样量为183.5997 mg,用75 mL水除杂,50%乙醇溶洗脱,剩下的条件按正交实验设计进行,收集洗脱液,定容至100 mL,测定总黄酮的含量,计算回收率。

表1　正交实验因素水平表

1.3数据统计分析

实验数据均为3次平行实验的平均值,用正交设计助手Ⅱv3.1软件进行正交结果分析,采用OriginPro 8.5.0软件作图。

2　结果与分析

2.1标准曲线方程

按照1.2.2中所述方法绘制标准曲线,得到标准曲线方程:A=11.249C+0.0044(R2=0.9998),表明对照品溶液质量浓度在0.2～1.8 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

2.2大孔吸附树脂型号的筛选

一般而言,树脂的吸附效果与树脂极性、孔径、比表面积有关[11]。由表2显示,比表面积大的D101、AB-8、HPD400、HPD500、HPD826的吸附率都比较高,而在这几种树脂中,弱极性的D101、AB-8的解吸率较高,其中D101和HPD826吸附和解吸效果较优。而D101树脂在医药食品研发领域应用非常普遍,对该树脂本身质量(如溶剂残留等)的研究较多。因此综合考虑,选择D101树脂作为新疆圆柏总黄酮富集纯化的最佳树脂型号。

表2　六种树脂静态吸附及解吸结果

2.3大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定

由图1可知,D101树脂的吸附率随时间的延长逐渐增加。当吸附时间达到8 h以后,树脂对黄酮的吸附率增长十分缓慢,吸附基本达到平衡。因此,D101树脂对新疆圆柏总黄酮的吸附时间为8 h。

图1　树脂静态吸附动力学曲线Fig.1　Kinetic curves of the static adsorption of resin

2.4动态吸附与解吸工艺研究

2.4.1上样浓度对吸附量的影响由图2可知,当上样量一定时,上样浓度对树脂吸附量有较大的影响。随着上样浓度的增加,溶质的溶解性越差,树脂吸附量逐渐降低,当上样浓度大于2.4512 mg/mL时,吸附量明显下降。而上样浓度过低,要使树脂达到相同的吸附量,则会耗时越长,影响效率。因此,选择最适的上样浓度为2.4512 mg/mL。

图2　上样浓度对吸附量的影响Fig.2　Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.4.2上样流速对吸附量的影响由图3可知,吸附量随上样流速的增大而下降。当上样流速在1.0～2.0 mL/min时下降趋势小,当上样流速达到3.0 mL/min以后下降趋势明显。一般而言,上柱液通过树脂柱越慢,越能与树脂充分接触,从而黄酮能更好地被树脂吸附;若上样流速太快,吸附量会随着流速的增加而降低[12]。综合工作效率和吸附效果考虑,选择上样流速为2.0 mL/min。

图3　上样流速对吸附量的影响Fig.3　Effect of sample flow rate on adsorption capacity

2.4.3最大上样量的确定由图4可知,从上样开始就有少量黄酮的泄露。在达到5 BV后出现明显泄露。随着上样量的增加,泄露的黄酮越多,当达到17 BV后泄露曲线变缓,说明树脂已基本达到饱和。为了避免造成总黄酮的浪费,选取最大上样体积为5 BV。

图4　D101树脂对总黄酮的吸附泄露曲线Fig.4　Leak curve of total flavonoids about D101 resin

2.4.4除杂用水量的确定由图5可知,随着除杂用水量的增加,杂质的质量逐渐减少。当除杂用水量达到5 BV后,杂质的质量很小且几乎不再发生变化,说明大部分的杂质已经被洗脱下来了。因此,选取5 BV的水除杂。

图5　除杂用水量的确定Fig.5　Effect of water consumption on removing impurity

2.4.5洗脱剂浓度的选择由图6可知,50%、70%、95%乙醇洗脱的回收率较高,而得到的总黄酮纯度随乙醇浓度的增加而降低。这可能是因为乙醇浓度越高,洗脱下来的物质越多,总黄酮的纯度也就越低。综合回收率和纯度考虑,选取50%乙醇作为洗脱溶剂。

图6　乙醇浓度对总黄酮回收率和纯度的影响Fig.6　Effect of ethanol concentration on recovery rate and purity

2.4.6洗脱剂用量的确定由图7可知,第1、2 BV已经洗脱下来大部分的黄酮,到第4 BV几乎全部被洗脱下来,之后的洗脱液中黄酮含量甚微。因此,选择4 BV的50%乙醇洗脱。

图7　黄酮动态洗脱曲线Fig.7　The dynamic desorption curve of flavonoids

2.4.7洗脱流速的考察由图8可知,总黄酮回收率随洗脱流速的增加而减少。当洗脱流速达到3.0 mL/min以后,总黄酮回收率缓慢减少。综合总黄酮回收率和工作效率的考虑,选取2.0 mL/min为洗脱流速。

图8　洗脱流速对总黄酮回收率的影响Fig.8　Effect of desorption rate on recovery rate of total flavonoids

2.5新疆圆柏总黄酮纯化工艺正交实验

由表3可知,4个因素对新疆圆柏总黄酮纯化回收率的影响大小依次为上样浓度>上样流速>洗脱流速>洗脱剂用量。新疆圆柏总酮纯化的最优组合为A1B1C2D1,即上样浓度1.2256 mg/mL,上样流速1.0 mL/min,洗脱剂用量4 BV,洗脱流速 1.0 mL/min。由表4可知,上样流速对新疆圆柏总黄酮纯化回收率的影响显著。根据最优组合条件进一步做验证实验,得出新疆圆柏总黄酮纯化回收率为88.36%,RSD为1.53%,纯度为69.96%,RSD为1.18%,符合正交实验中得到的结果,且结果重复性好,说明所选条件合理。

表3　正交实验结果

表4　方差分析表

注:F0.05(2,2)=19.000,*表示在p<0.05水平上差异显著。

3　结论

本研究结果表明,大孔树脂D101对新疆圆柏总黄酮的吸附和解吸效果较好,是纯化新疆圆柏总黄酮的理想树脂。D101纯化新疆圆柏总黄酮的最佳工艺是上样浓度1.2256 mg/mL,上样流速1.0 mL/min,除杂用水量5 BV,乙醇浓度50%,洗脱剂用量4 BV,洗脱流速1.0 mL/min。在此条件下大孔树脂D101纯化新疆圆柏总黄酮,总黄酮回收率为88.36%,纯度为69.96%,大孔树脂纯化前黄酮纯度提高了2.79倍。与已有研究的聚酰胺纯化结果[7]相比,D101大孔树脂纯化的总黄酮纯度达到了聚酰胺纯化的总黄酮纯度(69.54%)。因此,该纯化工艺简便、易行,重复性好,可作为新疆圆柏总黄酮的有效富集方法。

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Purification of total flavonoids from juniperus sabina l. by macroporous resin

LI Qian1,MAITITUERSUN Aosimanjiang2,LI Chen-yang3,XU Fang3,ZHAO Jun3，*

(1.College of Life Sciences&Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.College of Public Health,Xinjiang Medical Unicersity,Urumqi 830011,China; 3.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines,Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China)

By comparing the static adsorption effect of D101,AB-8,HPD400,HPD500,HPD417 and HPD826 macroporous resin,resin was screened out for separating total flavonoids from Juniperus sabina L.And purification process of total flavonoids from Juniperus sabina L.was optimized by orthogonal exceperiments based on single factor exceperiments.the results showed that D101 macroporous resin for total flavonoids had good separation effect.The optimal parameters for purification were as follows:the sample concentration of 1.2256 mg/mL,the sample flow rate of 1.0 mL/min,water consumption on removing impurity of 5 BV,ethanol concentration of 50%,eluting agent volume of 4 BV,desorption rate of 1.0 mL/min.Under these conditions total flavonoids had a recovery rate of 88.36% and a purity of 69.96%.

Juniperus sabina L.;total flavonoids;macroporous resin;purification

2015-09-17

李倩(1992-),女,硕士研究生,研究方向:药食兼用植物的研究与开发,E-mail:yaaitingzheng@163.com。

赵军(1973-),男,博士,研究员,研究方向:中药与天然药物化学研究,E-mail:zhaojun21cn@163.com。

国家自然科学基金(81160515)。

TS284.2

B

1002-0306(2016)07-0188-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.028