二重LAMP检测鸡蛋污染致病菌

赵　军，陈泽平，李　桢，宋小宁，李玉锋（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

二重LAMP检测鸡蛋污染致病菌

赵军，陈泽平，李桢，宋小宁，李玉锋*
（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

为快速检测污染鸡蛋的致病菌，实验从鸡蛋蛋体表面得到2株菌X1、X2，结合16S rRNA克隆及质粒测序分子方法对2株菌分类分析，发现2株菌X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。针对两种菌的nhe、nuc基因具有较强的保守性，设计2套环介导等温扩增（LAMP）引物。先进行反应体系优化，得到25 μL LAMP反应体系最适温度为60℃、最适MgSO4添加量为1.5 μL，引物最适量为2.0 μL。再进行二重LAMP鉴定2株污染鸡蛋的致病菌，发现目的菌X1和X2的特异性扩增结果为阳性，其他9株非目的菌扩增结果为阴性，其灵敏度检测限达10 fg/μL。此二重LAMP检测法有快速、特异、灵敏的特点，可快速检测食源性致病菌。

鸡蛋，致病菌，16S rRNA，环介岛等温扩增技术，快速检测

现阶段我国及世界对食品安全关注度越来越高。鸡蛋营养丰富，在我国的人均食用量逐年升高，近年来鸡蛋却经常出现食源性致病菌污染的安全问题，成为国内外消费者关注的焦点［1-2］。鸡蛋会被沾上的粪、毛等污染物“二次污染”，常见的致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等通过蛋壳表面残留物进行生长、代谢、传播［3-4］，增加了食品安全的风险。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术［5］是日本学者2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增技术，因其独特的核酸反应机理，产物在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出其典型的阶梯状条带，结果鉴定方便快捷，非常适合食源性致病菌的快速检测。LAMP技术以特有的灵敏、快速、特异等优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测：如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等［6-9］。Kayo-ko Ohtsuka等［10］抽样检测了110个可能被沙门氏菌感染的水样鸡蛋，使用LAMP技术对沙门氏菌的检出率为100%。李玉锋等［11］选用了不耐热肠毒素基因设计出LAMP引物，优化了LAMP的反应条件，并且考察了方法的特异性和灵敏性。相关报道但均未研究鸡蛋表面的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，且采用LAMP检测法均为单重，检测效率较低。实验从污染鸡蛋蛋体上分离致病菌，用16S rRNA分子方法和克隆测序，根据测序结果在NCBI中比对其在种属上分类。根据种属结果和特异性毒力因子基因设计两种致病菌的二重LAMP特异性引物。用二重LAMP进行快速、准确鉴定分离的鸡蛋致病菌，为二重LAMP鉴定食源性致病菌提供参考和理论依据。

1　材料及方法

1.1材料与仪器

鸡蛋成都市郫县的10个大型超市中随机购买鲜鸡蛋各10枚，个重0.045～0.055 kg，立即装入无菌冰袋中密封保存；单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp）、面包酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxingenic E.coli）四川省疾控中心；细菌基因组DNA提取试剂盒上海伟杰生物工程有限公司；pGEM-T easy载体系统和质粒小量提取试剂盒成都敬道生物有限公司；PCR试剂和LAMP试剂引物上海生工公司；DNA Marker DL2000和Premix ExTaq酶宝生物工程（大连）有限公司。

DYY-8B型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；低速离心机北京医用离心机厂；Eppendorf PCR仪

德国Eppendorf公司；台式离心机上海安亭科学仪器厂；1DHG-9140型电热恒温水浴锅上海精密实验设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菌株分离无菌条件下将样品分别用200 mL 0.85%的无菌生理盐水冲洗，将所得混悬液使用无菌生理盐水以10倍的梯度逐步稀释，选取合适的3个稀释度。取所得梯度稀释的各种混悬液0.1 mL无菌条件分别涂布于5%血琼脂培养基、亚硫酸铋琼脂培养基中，在37℃恒温条件下培养24 h。在血琼脂平板上生长出了中等大小2株菌，编号为X1、X2号。

1.2.2基因组DNA提取及未知菌鉴定

1.2.2.1细菌DNA的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书步骤实验：取菌液1.5 mL，离心后加缓冲液GA悬浮，37℃处理30 min，加入20 μL蛋白酶K混匀加入220 μL缓冲液GB，混匀后70℃温浴30 min。加入220 μL无水乙醇振荡混匀后移入吸附柱CB3中，离心后加入500 μL缓冲液GD后离心。向吸附柱提加入600 μL漂洗液PW，离心，最后加入75 μL洗脱缓冲液TE离心至收集管，即提取到细菌的基因组DNA。在0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取菌株的DNA。 1.2.2.2未知菌株的PCR扩增正向引物：Eu27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，10 μmol·L-1）；反向引物：1 490R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，10 μmol·L-1）。

PCR扩增PCR反应体系（25 μL）：ddwater 16 μL、10×Taq缓冲液（冰上解冻）2 μL、dNTP（冰上解冻）2 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL、上下引物和模板各1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL。

PCR条件：95℃预热5 min，95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10 min。

1.2.2.3重组质粒构建及16S rRNA鉴定对菌16S rRNA基因与pGEM-T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子。选择鉴定为阳性的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定。鉴定测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。测序结果通过16S rRNA序列校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度为99%的菌株，结果发现X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。对Bacillus cereus的nhe和Staphylococcus aureus的nuc基因进行二重LAMP鉴定。

1.2.3二重LAMP鉴定致病菌

1.2.3.1LAMP引物设计比较GeneBank数据库中相似菌株序列，显示nhe和nuc基因保守性好，采用LAMP引物设计的在线网站（http：//primerexplorer.jp/e/）进行引物的设计，依据LAMP引物设计的特点，选取了2组LAMP引物分别包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP，如表1。

1.2.3.2单重LAMP反应体系的优化用分离的致病菌X1进行单重LAMP实验，对反应体系进行优化。先确定25 μL反应体系中成分：10×Thermopol Buffer 2.5 μL；Betaine（4 mol/L）5 μL；4种引物各（F3∶B3∶FIP∶BIP=5∶5∶40∶40，μmol/L）2 μL；Bst DNA polymerase large fragment（8 U）1 μL；dNTPs（10 mmol/L）4 μL；MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL；模板1 μL；灭菌去离子水2 μL。

对影响扩增效率较大的Mg2+浓度、温度及引物浓度进行优化。在60℃条件下，Mg2+添加量分别设定为：1.3、1.5、1.6、1.7 μL。在Mg2+添加量为1.5 μL时，扩增温度分别设定为：58、60、62、64℃。在上述两个单因素结果基础上，引物浓度分别设定为：1.8、2.0、2.2、2.4 μL。对比扩增结果，依据2种LAMP扩增效率相同的原则，最终确定25 μL的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg2+浓度。

表1　两种食源性致病菌LAMP引物Table 1　Specific primer sequences for LAMP

1.2.3.3二重LAMP特异性检测致病菌把2套引物加入到优化后的同一反应体系（25 μL）中，以2株菌株X1和X2及非目标菌株的基因组DNA为模板分别进行LAMP检测，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证该方法检蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的准确性及特异性。

1.2.3.4二重LAMP灵敏性检测将致病菌蜡样芽孢杆菌X1、金黄色葡萄球菌X2的DNA模板（100 ng/μL）进行10倍梯度稀释为100～10-7倍至1 fg/μL，进行LAMP扩增，电泳检测结果。重复扩增该二重LAMP实验2次，取实验效果最好一组。

2　结果与分析

2.1致病菌PCR和质粒测序

用细菌通用引物27 f和1492 r对2株菌进行16S全长序列的PCR扩增，扩增结果如图1中A所示。对阳性克隆子进行质粒提取，结果如图1中B所示。

图1　细菌PCR扩增（A）和质粒提取（B）图谱Fig.1　PCR amplification（A）and plasmid extraction（B）

由图1知PCR扩增效果明显，2株菌的16S rRNA扩增均重复性好，清晰稳定。产物分子大小在2000 bp左右，符合原核微生物的16S rRNA基因片段大小［12］，达到了对致病菌的16S rRNA基因［13］的PCR扩增目的，也证实了所得菌的DNA提取比较成功。为了简便高效的检测出分离菌株的分类学地位，实验对PCR产物做克隆分析。图1中B质粒DNA分子大小在2000 bp和1200 bp之间，和PCR扩增细菌16S rRNA目的基因大小相符［14］，证明了克隆实验比较成功。通过电泳检测到完整的16S rRNA基因。将质粒进行测序，通过16S rRNA序列校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度99%的菌株结果发现X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。Bacillus cereus的nhe和Staphylococcus aureus的nuc基因可以表达出肠毒素，引起人体腹泻，具有较强的致病性［15-16］。

2.2蜡样芽孢杆菌LAMP反应体系优化

对Mg2+浓度、温度及引物浓度这三个反应条件进行优化。蜡样芽孢杆菌LAMP反应结果在1%琼脂糖凝胶电泳检测如下：

图2　LAMP反应体系优化图谱Fig.2　Electrophoresis of LAMP products

由图2组图中的特异性梯状条带可以知道LAMP反应较理想，所设计的针对nhe基因的引物可以特异性且准确的鉴定出从鸡蛋中分离的致病菌（X1）蜡样芽孢杆菌，且实验重现性好，条带清晰。由图2A中可以得到25 μL LAMP反应体系最适MgSO4添加量为1.5 μL，由图2B可知最适温度为60℃，由图2C知引物最适浓度为2.0 μL。以蜡样芽孢杆菌的LAMP扩增检测为基础进行LAMP反应体系优化，扩增条件的确定为进一步二重LAMP鉴定两种致病菌打下基础。实验中优化LAMP反应条件只用了一株菌进行实验，得到的条件再进行多重LAMP反应，可以快速方便得到较优的实验条件，但是也有不足：不能确定最优的二重LAMP反应的条件，所以二重LAMP反应条件有待进一步研究和进一步优化。

2.3二重LAMP特异性检测分离致病菌

采用二重LAMP特异性检测分离的2种致病菌X1、X2，结果如图3所示。

图3LAMP特异性检测致病菌图谱Fig.3　Detection specificity of LAMP reaction for strain

由图3可以知道LAMP扩增结果中致病菌X1、X2条带呈梯状，结果为阳性。其他9株菌（图3中1～9）无梯状条带，扩增结果为阴性。对比0中的空白对照可以知道阳性结果准确。表明二重LAMP检测污染鸡蛋的两种致病菌X1蜡样芽孢杆菌、X2金黄色葡萄球菌较成功，且反应快速、简便特异性强，为快速检测鸡蛋致病菌提供依据。实验中两套引物在11种不同DNA模板环境中还能相互特异的扩增，表明引物特异性强。实验采用二重LAMP对分离致病菌进行一步检测，比传统的PCR和现阶段的单重LAMP更加方便、快捷，且反应的特异性强，灵敏度高，足见在检测致病菌有较多的优势。但多重LAMP随着检测样的增多，前期合成和互配筛选特异性引物工作量大，且引物数量随样品增多也成倍增加，引物间相互干扰和其他综合反应增多，使得不确定因素增多，使得多重LAMP反应相对困难。实验中的鸡蛋污染致病菌由于经过扩增培养，其DNA可以较好提取，进而方便快速进行二重LAMP鉴定，这为相对污染程度较低的加工包装食品致病菌快速检测提供参考。

2.4LAMP特异性检测分离致病菌的灵敏度

对两种鸡蛋污染致病菌的模板质量浓度从10 ng/μL DNA进行10倍梯度稀释至10-7倍（1 fg/μL），即DNA模板质量浓度10、1 ng/μL，100、10、1 pg/μL，100、10、1 fg/μL进行LAMP扩增，电泳结果如图4所示。

图4　LAMP灵敏度图谱Fig.4　The sensitivity of LAMP

由图4知二重LAMP灵敏度检测效果较理想，两菌DNA模板进行10倍梯度稀释至10-6倍（10 fg/μL）仍能扩增出较清晰的梯状条带，而稀释至10-7倍（1 fg/μL）的低浓度时则检测不出。比较易海华等［17］用LAMP检测单增李斯特菌中的灵敏度结果1.72×101拷贝/反应模板量，检测度高，实验结果的灵敏度与之相差较小，进一步证明二重LAMP反应中灵敏度受多种引物及模板的影响较小。对比姜侃、吕沁风等［18］在三重LAMP进行食品致病菌检测中的PCR检测度10 pg/μL，发现实验中采用二重LAMP扩增检测鸡蛋污染致病菌灵敏度能高于普通PCR扩增检测限1000倍。表明了二重LAMP鉴定鸡蛋污染致病菌灵敏度高的特点。

实验结果检测还可以通过观察LAMP反应产生的焦亚硫酸镁沉淀［19］和SYBR-GREENⅠ染色［20］后在紫外呈黄色的方法。还可以进一步结合荧光定量［21］实时直观的探究扩增过程。本实验只是用较简便的琼脂糖凝胶电泳检测，得到比较理想的阳性检测结果。但LAMP反应只有阴性和阳性两种结果，实验时容易出现假阳性，且检测灵敏度太高而容易导致污染，给结果带来较大影响。故需要注意在不同房间、地点进行不同种属菌的二重LAMP反应试剂添加，人员互换避免污染而出现假阳性，且反应靶序列长度控制在300 bp以下，一旦产生非特异性扩增，则不易鉴别［22］。如果进一步改进和完善LAMP的这些不足，可以使二重LAMP在食品、卫生鉴定致病菌方面运用的潜力更巨大。

3　结论

通过对污染鸡蛋的微生物进行分离纯化，得到2株菌X1和X2。用16S rRNA和克隆的分子方法对分离的细菌进行鉴定。在基因库中对比选择相似度高达99%的结果，发现2株菌X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401（AP007209）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（AP003088）。

针对两种致病菌X1和X2的毒力致病因子基因nhe、nuc有保守度高，特异性强的特点设计2对不同特异性LAMP引物，进行单因素实验优化反应条件得到25 μL LAMP反应体系最适温度为60℃、最适MgSO4添加量为1.5 μL，引物最适浓度为2.0 μL。再用二重LAMP反应对致病菌检测，结果发现二重LAMP虽然受到不同菌株的引物、模板及浓度等多种因素影响，使综合反应复杂，但是仍然可特异性、准确的鉴定出目的致病菌X1和X2，而非目的菌均未出现特异性扩增结果。二重LAMP反应鉴定致病菌灵敏度也较高，达到10 fg/μL，这比刘昊、黄文胜等［23］用LAMP方法检测开心果DNA中的0.2 ng/L灵敏度还高。表明此方法可以快速、方便、准确的鉴定鸡蛋污染致病菌。为进一步研究二重LAMP试剂盒以快速检测食品中蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌提供理论依据。

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Multiplex LAMP method for the detection of pathogenic bacteria in eggs

ZHAO Jun，CHEN Ze-ping，LI Zhen，SONG Xiao-ning，LI Yu-feng*
（College of Food and Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，China）

Two strains of bacteria named X1，X2were found to detect the pathogenic bacteria on eggs.Combined with 16S rRNA molecule methods，testing the cloned plasmid sequence，blasting the sequence with NCBI in GenBank.The results showed that X1was Bacillus cereus NC7401（AP007209）and X1was Staphylococcus aureus（AP003088）.According to the highly conservative gene nhe and nuc，two sets of primers were designed. The optimized LAMP reaction system contained MgSO41.5 μL，each primer 2.0 μL and reaction temperature of 60℃.The specificity was verified by using 9 strains of non-targeting bacteria and targeting bacteria X1，X2. The LAMP assay showed a sensitivity of 10 fg/μL.The novel multiple LAMP method reported here was characteristics of rapid detection，high specificity and excellent sensitivity，which could be applied in the detection of pathogenic bacteria.

egg；pathogenic bacteria；16S rRNA；loop-mediated isothermal amplification；rapid detection

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.012

2015－07－17

赵军（1989-），男，在读硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：137495917@qq.com。

李玉锋（1965-），男，博士研究生，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：907493056@qq.com。