家蚕杆状病毒(BmNPV)Bm122基因的缺失影响芽生型病毒粒子的形成

朱丽萍，于　威,b，陈　滨,b，何　欢,b，解纯刚,b

(浙江理工大学，a.生物化学研究所；b.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州 310018)



家蚕杆状病毒(BmNPV)Bm122基因的缺失影响芽生型病毒粒子的形成

朱丽萍a，于威a,b，陈滨a,b，何欢a,b，解纯刚a,b

(浙江理工大学，a.生物化学研究所；b.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州 310018)

为研究家蚕杆状病毒(BmNPV)编码的Bm122基因的生物学功能，利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid，实现对Bm122基因的敲除和异位补回。进而将Bm122-ko-bacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid(野生型)分别转染BmN细胞，病毒滴度测定结果显示：Bm122缺失后，病毒无法形成正常水平的芽生型病毒粒子(budded virus，BV)，表明该基因是病毒生成有感染力的BV所必需的基因；透射电子显微镜观察发现，Bm122敲除后细胞内未观察到杆状病毒粒子，进一步证实Bm122的缺失影响了BV的生成。qPCR结果显示，Bm122缺失后病毒DNA复制水平降低。结果表明，Bm122是病毒生成正常水平的BV所必需的基因。

家蚕杆状病毒；Bm122基因；Red重组技术；Bac-to-Bac系统；病毒复制

0　引　言

杆状病毒是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒。杆状病毒基因组为共价闭合环状DNA，基因组大小在80～180 kb之间。根据ICTV网站上发布的最新分类，杆状病毒分为α、β、δ、γ杆状病毒属。病毒粒子分为包涵体来源型病毒粒子(occluded virions，ODV)和芽生型病毒粒子(budded virions，BV)，两种不同表型的病毒粒子产生于病毒感染周期的不同时期，产生的细胞部位和形态结构也不同[1]。对家蚕杆状病毒(Bombyxmorinucleopolyhedro virus，BmNPV)的核酸序列分析表明，它与苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)序列同源性高达90 %，但它们的宿主截然不同。BmNPV基因组全长128413 bp，其(G+C)%为40 %，有136个开放阅读框编码的蛋白含有超过60个氨基酸[2]。杆状病毒许多基因跟BV滴度下降有关但并不影响病毒DNA复制，如pp31、gp64、Bm118、Bm117、Bm111等基因[3-7]；有些基因敲除后会导致不能产生BV，但它们的缺失并不影响病毒DNA复制，比如Bm92、Bm119[8]、lef-2[9]等基因；有些基因缺失导致病毒不能产生BV，且影响病毒DNA复制，如Bm101[10]；而有些基因的缺失导致病毒不能产生BV，且检测不到病毒相关蛋白的表达，如Bm25[11]。家蚕杆状病毒基因Bm122位于家蚕核型多角体病毒T3株基因组116323-116928 nt，读码框全长606 bp，编码的蛋白大小约23 kD。Bm122存在于所有的鳞翅目基因组中。有研究表明，Bm122转录起始于转染后3 h，由宿主的RNA聚合酶Ⅱ转录，由此推测它是一个早期基因[12]。Bm122基因编码的蛋白定于细胞核内，推测它可能与病毒DNA复制及晚期基因表达有关。其同源基因Ac146与Bm122相似度达97 %，Ac146是一个晚期基因，Ac146的缺失导致病毒不能产生有感染性的BV[13]。有研究者通过将Bm122缺失后的bacmid连接GFP后证实该基因缺失后病毒无法进行细胞间的感染[14]。利用生物信息学的相关软件对Bm122进行了生物信息学分析，发现BM122蛋白不含跨膜结构域，但是在N-端存在一个信号肽。本文利用分子生物学和细胞生物学等手段对Bm122的功能进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料

DH10Bac、大肠杆菌TG1、BW25113菌种、质粒pFastBac1和pKD3质粒均为本实验室保存。

L-阿拉伯糖购自Promega公司，pMD18-T vector、T4 Ligation、限制性内切酶及PCR试验所需试剂均购自TaKaRa公司，KOD plus高保真酶购自TOYOBO公司。其余试剂均为国产分析纯。引物由上海桑尼公司合成。

Sf-900ⅡSFM(1×)无血清培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，脂质体转染试剂SuperFectinTM II In Vitro DNA Transfection Reagent购自普飞公司，细胞培养瓶及培养皿购自康宁公司，荧光定量PCR试剂盒购自Roche公司，DpnI和基因组DNA小量抽提试剂盒购自中国碧云天生物科技有限公司。

1.2Bm122基因的缺失与补回

1.2.1Bm122基因缺失型bacmid构建

设计一对引物，扩增出氯霉素基因完整序列，构建了一个用于Bm122基因敲除的线性化片段。这对引物分别由50 bp的Bm122基因同源区(下划线标注)和20 bp的氯霉素基因同源区组成。以pKD3(含有氯霉素抗性基因cat)质粒为模板，Bm122-cmF和Bm122-cmR为引物扩增获得1100 bp左右的线性片段，该线性片段转化BW25113(含质粒pKD46和bacmid)感受态细胞，涂布含氯霉素和卡那霉素抗性的LB固体培养基进行筛选。在λRed重组酶的作用下，含氯霉素基因的打靶片段和目的基因Bm122发生同源重组(如图1a所示)。PCR扩增引物序列如下：Bm122-cmF:5′-TGTGCGCTAGCATGCC

CGTAACGGACCTTGTGCTTTTGGCTTCAAAGG

TTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；Bm122-cmR:5′-GACACGAGGAGCGTACGTGATCAGCTGCATT

CGCGCGCCGCGCCTTTATCATGGGAATTAGCCA

TGGTCC-3′。将Bm122缺失型bacmid命名为Bm122-ko-bacmid。

1.2.2Bm122补回型bacmid构建

根据Bm122完整的基因序列进行引物设计，引物序列为：pFbBm122-F:5′-CGGGATCCCAGTCTCG

CTGTCAGATACT-3′(下划线BamH I酶切位点)，pFbBm122-R:5′-CGGAATTCGCGGCTCGCATGTA

TAGAAA-3′(下划线为EcoR I酶切位点)。以wtbacmid(野生型)为模板，利用该对引物扩增出Bm122基因的完整编码框。PCR扩增所得片段和转移载体pFastBac1分别经BamH I和EcoR I双酶切后连接，获得pFastBac1-Bm122(如图1)。将重组质粒pFastBac1-Bm122再转化Bm122缺失型的大肠杆菌DH10Bac(内含辅助质粒和bacmid)，通过转座作用将Bm122基因异位补回(如图1b所示)。用含卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG、X-gal的多抗板筛选阳性重组质粒。将Bm122补回型bacmid命名为Bm122-re-bacmid。

图1　Bm122基因缺失型和补回型重组病毒的构建示意注：(a)以pKD3质粒为模板，扩增Bm122打靶片段，打靶片段与wtbacmid上Bm122基因位点内相应片段同源重组，构建Bm122基因缺失型重组病毒Bm122-ko-bacmid；(b)Bm122完整编码框连接到转移载体上，将Bm122异位补回到Bm122-ko-bacmid上的polh启动子下游，构建Bm122基因补回型重组病毒Bm122-re-bacmid。

1.3病毒滴度测定

为了研究Bm122的缺失对病毒增殖的影响，3种bacmid分别转染家蚕BmN细胞后，在不同时间点(24、48、72 h和96 h)收集细胞培养上清液，利用TCID50终点稀释法测定病毒滴度。取处于对数生长期的BmN细胞按每孔10000个细胞铺96孔板，病毒上清按10倍梯度稀释，各稀释度做8个重复。边缘两列不加病毒，以正常的BmN细胞作阴性对照。37℃培养箱中培养7 d，每天观察并记录各稀释度的发病情况，TCID50终端稀释法计算病毒滴度。

1.4透射电镜观察病毒装配与增殖情况

为研究Bm122基因的缺失是否影响病毒核衣壳的结构[15]，收集3种bacmid转染72 h后的细胞，于透射电镜下观察。Bm122-ko-bacmid、wtbacmid和Bm122-re-bacmid各1 μg转染家蚕BmN细胞，72 h后轻轻吹下细胞，PBS洗两次，加入2.5 %戊二醛，4℃固定过夜；倒掉固定液，0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；1 %锇酸溶液固定样品1～2 h；0.1 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min；再使用30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、95 %乙醇依次各洗1次，每次15 min；用100 %乙醇处理20 min；纯丙酮处理20 min；用包埋剂与丙酮的混合液(体积比1∶1)处理样品1 h；用包埋剂与丙酮的混合液(体积比3∶1)处理样品3 h；纯包埋剂处理样品过夜；70 ℃加热过夜，样品在LEICA EM UC7 型超薄切片机中切片，切片厚度为70～90 nm，再切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50 %乙醇的饱和溶液各染色5 min至10 min，在Hitachi H-7650型透射电镜中观察。

1.5qPCR分析Bm122基因缺失对病毒复制的影响

设计一对引物gp41-F:5′-CGTAGTGGTAGTAATCG

CCGC-3′，gp41-R:5′-AGTCGAGTCGCGTCGCTTT-3′，位于基因gp41的开放阅读框内[16]。该对引物与BmNPVgp41基因互补配对，扩增100 bp的病毒基因组DNA片段，该区域含有4个DpnI限制性位点。为校正上样量的误差，引入内参照基因β-Actin，其扩增引物为β-Actin-F:5′-GCGCGGCTACTCGTTCACT-3′，β-Actin-R:5′-TGCCGCAAGCTTCCATACCC-3′。

分别取Bm122-ko-bacmid、wtbacmid和Bm122-re-bacmid各1 μg转染家蚕BmN细胞(5×105个细胞/孔)，分别在转染后的24、48、72、96 h收集细胞，提取细胞内总DNA，并用DpnI酶消化掉转入的外源bacmid，经处理的DNA进行qPCR分析。

2　结果与分析

2.1Bm122基因的缺失和补回鉴定

2.1.1缺失型bacmid鉴定

以pKD3(含有氯霉素抗性基因cat)质粒为模板，Bm122-cmF和Bm122-cmR为引物扩增获得1100 bp左右的线性片段，即Bm122基因打靶片段(如图2b所示)。该片段含cat基因的完整编码框，转化BW25113后与wtbacmid发生同源重组后，可在卡那霉素和氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆，用碱裂解法提取bacmid。PCR鉴定引物为：Bm122-F:5′-GAAGAGTGGCTTTCTAGTTG-3′，Bm122-R:5′-CTAATGGCGAACACGATAATAA-3′，

cat-F:5′-CACGTTTAAATCAAAACTGGTG-3′，cat-R:5′-CAATATGGACAACTTCTTCG-3′。引物cat-F和cat-R是氯霉素基因内部引物。鉴定引物组合分别为Bm122-F和Bm122-R、Bm122-F和cat-R及cat-F和Bm122-R。各引物对应的位置如图2(a)所示。电泳结果如图2(c)所示。1-3泳道以wtbacmid为模板，第1泳道产物预期大小为580 bp，2、3泳道无条带，因为wtbacmid中Bm122基因是完整的，无cat基因的插入，故无扩增产物；4-6泳道以Bm122敲除后所提取的bacmid为模板，预期扩增产物大小依次为1600 bp、450 bp、1150 bp。从图2中可看出，电泳产物大小分别与预期大小相符，表明Bm122敲除成功。

图2　Bm122基因敲除型病毒的鉴定注：(a)设计两对鉴定引物Bm122-F/Bm122-R和cat-F/cat-R，利用这两对引物进行交叉PCR，确保cat基因成功插入Bm122基因内部以实现对Bm122基因的敲除；(b)以氯霉素抗性基因为模板PCR扩增的打靶片段大小为1100 bp左右；(c) Bm122基因敲除鉴定：M：DL15000 DNA Marker；1-3泳道为阴性对照，引物组合依次为Bm122-F和Bm122-R、Bm122-F和cat-R、cat-F和Bm122-R；4-6泳道为敲除鉴定结果，引物组合依次为Bm122-F和Bm122-R、Bm122-F和cat-R、cat-F和Bm122-R。

2.1.2补回型bacmid鉴定

在含卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG和X-gal的多抗平板上随机挑取白色单菌落，接种于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。提取病毒bacmid进行PCR鉴定。M13-F:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，M13-R:5′-CAGGAAA

CAGCTATGAC-3′，pFbBm122-F:5′-CGGGATCCCAGTC

TCGCTGTCAGATACT-3′，pFbBm122-R:5′-CGGAATTCGCGGCTCGCATGTATAGAAA-3′。引物组合分别为M13-F和M13-R、M13-F和pFbBm122-R及pFbBm122-F和M13-R。各引物对应位置见图3(a)所示。鉴定结果如图3(b)所示。1-3泳道条带预期大小依次为3163 bp、2513 bp、1553 bp，从图3中可看出电泳产物大小分别与预期相符，表明Bm122已成功补回。

图3　Bm122基因补回型病毒的鉴定注：(a)通过转座作用将pFastBac1-Bm122重组到Bm122缺失型bacmid上游M13位点内的转座整合靶位点，利用M13-F、M13-R和Bm122自身引物pFbBm122-F、pFbBm122-R交叉PCR鉴定；(b)1-3泳道依次是以M13-F和M13-R、M13-F和pFbBm122-R、pFbBm122-F和M13-R为引物对扩增的产物。

2.2病毒滴度测定结果分析

碱裂法提取wtbacmid、Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid，各1 μg分别转染BmN细胞，在特定时间点收集细胞培养上清液，测定上清液的病毒滴度，结果如图4所示。wtbacmid型病毒的滴度随时间的增加逐渐增加，Bm122-re-bacmid型病毒的滴度也恢复到野生型水平，但是Bm122-ko-bacmid型病毒的滴度在各个时间点均为零，这说明Bm122-ko-bacmid转染的家蚕BmN细胞内不能产生有感染力的BV。

2.3透射电镜观察病毒增殖

为进一步研究Bm122缺失后细胞内是否能产生正常水平的BV，将Bm122-ko-bacmid、wtbacmid和Bm122-re-bacmid各1 μg转染家蚕BmN细胞后，72 h收集细胞，制样，透射电镜观察。结果如图5-图7所示：wtbacmid和Bm122-re-bacmid转染的细胞内清楚可见许多正在装配或已成熟的病毒粒子。但是Bm122-ko-bacmid转染的细胞内并未观

察到BV结构。由电镜结果分析得出，Bm122基因的缺失导致病毒不能产生正常水平BV。

图4　wtbacmid、Bm122-re-bacmid和Bm122-ko-bacmid转染细胞后病毒滴度分析

图5　wtbacmid转染家蚕BmN细胞后超薄切片透射电镜照片

图6　Bm122-re-bacmid转染家蚕BmN细胞后超薄切片透射电镜照片

图7　Bm122-ko-bacmid转染家蚕BmN细胞后超薄切片透射电镜照片

2.4Bm122基因缺失对病毒DNA复制影响

为研究Bm122敲除后病毒滴度为零是否因为Bm122的敲除影响了病毒基因组的正常复制，进行了qPCR验证。结果如图8所示，随着时间的增加，wtbacmid型病毒DNA的复制水平逐渐增加，Bm122-re-bacmid型病毒DNA的复制水平也几乎恢复到了wtbacmid型病毒DNA的复制水平。而Bm122-ko-bacmid型病毒DNA的复制水平明显低于前两者，且在转染后48h呈下降趋势，这可能是因为最初转染的细胞死亡导致病毒不能继续复制，也进一步说明Bm122缺失后，病毒无法产生BV，不能进行细胞间感染。因此Bm122-ko-bacmid型病毒DNA的复制水平较wtbacmid型病毒和Bm122-re-bacmid型病毒低的原因可能是因为Bm122缺失导致病毒不能感染更多的细胞，所以只有在起始转染的细胞内有DNA的复制，或者是Bm122基因的缺失确实影响了病毒DNA的正常复制。

图8　wtbacmid、Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid转染BmN细胞病毒拷贝数随转染后时间变化的qPCR分析

3　讨　论

本研究通过Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别实现对Bm122基因的敲除和异位补回。将Bm122缺失和补回型的bacmid与wtbacmid同时分别转染家蚕BmN细胞，病毒滴度分析表明Bm122的缺失导致病毒不能形成有感染力的BV；透射电镜观察显示Bm122缺失后细胞内无BV生成。qPCR结果表明Bm122基因缺失后，在转染的初期细胞内仍有病毒DNA复制，且在转染48 h后不再增加，但Bm122缺失型病毒DNA复制水平明显低于wtbacmid和Bm122补回型bacmid，这可能是由于病毒无法进行细胞间感染造成的，或者Bm122的缺失影响了病毒DNA的复制。对BM122蛋白的信号肽分析表明，BM122蛋白内有一个信号肽，剪切位点位于从N端开始的第16和17个氨基酸处。但是没有跨膜结构域，推测它可能在引导与病毒毒性相关的蛋白或者核衣壳蛋白参与病毒粒子的装配，或者调解相关蛋白功能方面有重要作用。综上所述，Bm122基因是病毒BVs的形成所必需的基因，它可能在决定核衣壳最终能否装配成BV或ODV方面起重要作用。Bm122基因是病毒生活周期中一个不可缺少的基因，Bm122基因如何影响BV的生成以及对病毒DNA复制的影响还有待于进一步的研究。

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(责任编辑： 许惠儿)

Influence of Deficiency in BombyxMori Nuclear Polyhedrosis Virus (BmNPV)GeneBm122 on the Production of Budded Virus

ZHULipinga,YUWeia,b,CHENBina,b,HEHuana,b,XIEChunganga,b

(a.Institute of Biochemistry; b. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To study the biological function of BmNPV-encodedBm122 gene, we constructed aBm122 knockout bacmid (Bm122-ko-bacmid) andBm122 repair bacmid (Bm122-re-bacmid) to achieve knockout and repair ofBm122 gene by using Red recombinat technology and Bac-to-Bac system respectively. Then, transfect BmN cells withBm122-ko-bacmid, Bm122-re-bacmid and wtbacmid (wild type bacmid), and virus titer measuring results indicate that, with theBm122 deficiency, virus is unable to produce infectious BV (budded virus) of normal level. In addition,it also shows that the gene is the necessary gene required by virus to generate infectious BV. No baculovirus particles were found in cells through transmission electron microscopy afterBm122 knockout, further proving that lack ofBm122 affects the generation of BV. qPCR results show that the level of viral DNA replication inBm122-ko-bacmid is evidently reduced. In conclusion,Bm122 is essential to the production of BV of normal level.

BmNPV;Bm122 gene; Red-recombination; Bac-to-Bac system; viral replication

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.03.020

2015-06-30

国家高技术研究发展计划“863”项目(2011AA100603)；浙江省自然科学基金项目(Y207217)

朱丽萍(1988-)，女，安徽阜阳人，硕士研究生，主要从事家蚕生物反应器与蛋白质组学方面的研究。

解纯刚，E-mail：chungxie@126.com

Q812

A

1673- 3851 (2016) 02- 0277- 06 引用页码： 030702