CDK抑制剂SNS-032联合AD55-Apoptin对肝癌细胞Huh-7的体外抗癌作用

孙笑竹，吕春伟，秦　云，韩建翠，王毅刚

(浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018)



CDK抑制剂SNS-032联合AD55-Apoptin对肝癌细胞Huh-7的体外抗癌作用

孙笑竹，吕春伟，秦云，韩建翠，王毅刚

(浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018)

通过CDK抑制剂SNS-032联合AD55-Apoptin处理肝癌Huh-7细胞，以探究两者联合作用的体外抗癌作用。采用MTT法分别检测SNS-032、AD55-Apoptin以及SNS-032与AD55-Apoptin联合对肝癌细胞株Huh-7生长的抑制作用；利用Hoechst33342染色观察所处理细胞的凋亡形态学变化，采用流式细胞术对凋亡进行量化，Western Blot检测凋亡相关蛋白表达情况。结果表明：10MOI的AD55-Apoptin联合100ng/mL的SNS-032处理96h后，Huh-7细胞的存活率仅为4%，而10 MOI的AD55-Apoptin和100ng/mL SNS-032分别单独处理后细胞存活率为60%和8%(P<0.05)；Hoechst33342染色、流式检测及Western Blot结果表明，联合处理组细胞凋亡现象更明显。实验结果证明SNS-032联合AD55-Apoptin能有效的抑制肝癌细胞Huh-7生长，并诱导其凋亡。

CDK抑制剂(SNS-032)；AD55-Apoptin；肝癌；体外；抗癌作用

0　引　言

抗肿瘤研究的难点是如何找到一种治疗手段，在杀伤癌症细胞的同时，对正常组织产生的影响尽量小。然而，常用的放化疗手段都会对正常机体产生很大的毒副反应，因此，新的治疗手段成为癌症治疗方向的研究热门[1]。近年来，中科院刘新垣院士提出的肿瘤的靶向基因-病毒治疗策略(cancer targeting gene-viro-therapy)已经成为一个研究热点[2]。该课题组利用基因工程技术，对5型腺病毒进行改造，得到的病毒称作ZD55[3-4]。本课题所使用的病毒由Zhang等提供，其将ZD55 的E1A区启动子改造为肝癌特异性启动子甲胎蛋白启动子AFP，并由其启动插在E1B处外源基因Apoptin的表达，成为产物AD·AFP·E1A·E1B(△55)·Apoptin，改造后的病毒简称为AD55-Apoptin。体内实验及体外实验结果均表明，携带抑癌基因的重组腺病毒AD55-Apoptin具有更高的抗肿瘤效应和更低的毒副作用。

Apoptin 是一种可以特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞不产生影响的蛋白[5]，其通过在细胞中定位不同来诱导细胞凋亡。Apoptin蛋白主要定位于肿瘤细胞的细胞核中，正常细胞的细胞质中[6]。Apoptin可不依赖于p53基因诱导肿瘤细胞凋亡[7]，并且其诱导肿瘤细胞的凋亡不受Bcl-2家族影响，而是受线粒体释放的细胞色素c和激活的caspase-3和caspase-7影响[8]，有研究认为该机制是通过调节鞘磷脂-神经酰胺的作用来实现的[9]。尽管Apoptin诱导细胞凋亡的机制还不是完全清楚，但其自身特性和低毒性使其成为理想的肿瘤基因治疗药物[10]。一些研究表明，Apoptin有良好的抗癌效果和安全性[11-14]。

SNS-032是一种对细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)有抑制作用的新型胺噻唑化合物，其主要通过抑制CDK2、7、9发挥作用[15]。这种化合物因其选择性抑制Cdk2活性及较低的蛋白结合能力而进入临床研究[16]。在恶性血液细胞中，其通过抑制血小板源生长因子受体而发挥作用[17]。SNS-032可通过同时抑制cFlip和Mcl-1来克服TRAIL抗性[18]。SNS-032可用于多种肿瘤的治疗，包括急性粒细胞性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、结肠癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[19- 20]等的治疗，目前该药物已处于CLL、MM及其转移性难治性实体瘤的Ⅰ期临床试验阶段[21-22]。

癌症细胞由于其代谢信号纷繁复杂且具有多基因遗传特性，因此，单一药物对其治疗效果有限，药物联用可以取得更好的治疗效果，一直是抗癌研究的热点。本课题组之前的研究表明，AD55-Apoptin相对于ZD55，AD55有更好的安全性以及对肝癌不同细胞株的杀伤能力，且SNS-032对部分肿瘤细胞有良好的抑制生长作用，将两者联合期待达到更好的对Huh-7细胞的杀伤作用。本研究证明SNS-032联合AD55-Apoptin，对肝癌细胞株Huh-7具有更强的杀伤作用，为病毒基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症的进一步研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

MTT、Hoechst33342凋亡试剂购于Sigma公司，PVDF膜购自Millipore公司，二甲基亚砜(DMSO)购自上海国药，病毒AD55-Apoptin为本实验室所有，HEK293细胞、肝癌Huh-7细胞、肝正常L-02细胞、肺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、胰腺癌PANC-1细胞、结肠癌SW620细胞都来自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，Caspase-3、7、8以及PARP、 XIAP、GAPDH抗体均购自CST公司，二抗购自Santa Cruz。蛋白胶配制相关溶液均购自碧云天公司，Thermo超净台，DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)，XDS-1B倒置生物显微镜(Olympus公司)， BD Accuri C6型号的流式细胞仪(BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

HEK293细胞、Huh-7细胞、L-02细胞、A549细胞、MCF-7细胞、PANC-1细胞、SW620细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基于37℃、5% CO2培养箱中进行培养, 2～3 d传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2AD55-Apoptin的靶向复制能力分析

将对数生长期的肝正常细胞L-02及肝癌细胞Huh-7按1×105/孔密度接种到24孔板中，待细胞贴壁后加入10MOI鉴定好的溶瘤腺病毒AD55-Apoptin，72h后用移液器将细胞吹打下来，之后收集培液与细胞于离心管中，反复冻融3次彻底裂解细胞，2000 r/min离心3min，取上清。TCID50法测量病毒滴度。

1.2.3AD55-Apoptin的安全性分析

向96孔板中按照5×103/孔的密度接种肝正常细胞L-02，待其贴壁后分别加入0.1 MOI、1 MOI、10 MOI溶瘤腺病毒AD55-Apoptin，每组设置6个复孔。不加细胞组为调零组，不加AD55-Apoptin组为对照组，按照上述培养条件培养96h。向每个孔中加入预先配置好的MTT(5mg/mL)溶液20 μL，继续培养4h。用真空泵小心吸去上清，每孔加入150μL的DMSO溶液，摇床震荡15min，甲瓒晶体完全溶解后，利用酶标仪测570nm吸光值(A570)。按照公式计算细胞存活率，重复3次。

1.2.4MTT法分析不同处理组对肝癌细胞株Huh-7的体外抑制作用

向96孔板中按照5×103/孔的密度接种肝癌细胞Huh-7，待其贴壁后分别加入不同浓度待测药物，每组设置6个复孔。不加细胞组为调零组，不加药物组为对照组，按照上述培养条件培养24、48、72、96 h。向每个孔中加入预先配置好的MTT(5 mg/mL)溶液20 μL，继续培养4h。用真空泵小心吸去上清，每孔加入150 μL的DMSO溶液，摇床震荡15 min，甲瓒晶体完全溶解后，利用酶标仪测570 nm吸光值(A570)。按照公式计算细胞存活率，重复3次。

1.2.5MTT法分析不同处理组对不同肿瘤细胞系的体外抑制作用

向96孔板中按照5×103/孔的密度接种对数生长期的肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7，胰腺癌细胞PANC-1，结肠癌细胞SW620，肝癌细胞Huh-7，待其贴壁后分别加入不同浓度待测药物，每组设置6个复孔。不加细胞组为调零组，不加药物组为对照组，按照上述培养条件培养24、48、72、96 h。向每个孔中加入预先配置好的MTT(5 mg/mL)溶液20 μL，继续培养4h。用真空泵小心吸去上清，每孔加入150 μL的DMSO溶液，摇床震荡15 min，甲瓒晶体完全溶解后，利用酶标仪测570 nm吸光值(A570)。按照公式计算细胞存活率，重复3次，计算各组对不同细胞系的抑制作用。

1.2.6Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞形态

向24孔板中按照1×105/孔的密度接种对数生长期的Huh-7细胞，细胞贴壁后， 加入100 ng/mL的SNS-032或/和10 MOI AD55-APOPTIN，按照上述条件培养48h后，加入5 μL Hoechst33342(1 mg/mL)染料，避光孵育30min，荧光显微镜下检测细胞核变化。

1.2.7流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率

6孔板以5×105的密度接种Huh-7细胞，37 ℃、5% CO2培养24h后，加药组加入100 ng/mL的SNS-032或/和10 MOI AD55-APOPTIN，对照组中加入等体积的PBS，继续培养48 h。之后按照凯基流式凋亡试剂盒说明书操作。

1.2.8Western Blot检测凋亡相关蛋白

6孔板以5×105的密度接种Huh-7细胞，37 ℃、5% CO2培养24 h后，加药组加入100 ng/mL的SNS-032或/和10 MOI AD55-APOPTIN，对照组中加入等体积的PBS，继续培养。48 h后将6孔板置于冰上，吸去培养基，用预冷的PBS洗两次，每组加入100μL含PMSF的IP裂解液，冰上静置30 min，用细胞刮将其收集起来，12000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，加入5×上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min。用BCA试剂盒定量上述蛋白，之后每孔加入25 mg总蛋白进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后利用半干转将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜3次，每次15min。按照说明书稀释一抗，一抗孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加入稀释好的二抗，避光孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，加入显色液，扫膜，检测目的蛋白的表达。

1.2.9统计学处理

所有实验数据使用 Microsoft office 2007及Graph Pad Prism5.0处理，以MEAN±SD表示，P<0.05为显著性差异。

2　结　果

2.1AD55-Apoptin的靶向复制能力分析

肝正常细胞株L-02和肝癌细胞株Huh-7经10MOI溶瘤腺病毒AD55-Apoptin感染72h后，收集培液和细胞，反复冻融3次，2000r/min离心3min

取上清，TCID50法测病毒滴度(图1)。如图1所示，改造后的溶瘤病毒在肿瘤细胞株Huh-7中的复制能力远远大于在肝正常株L-02中的复制能力，这说明启动子AFP的改造可增强其对Huh-7细胞株的靶向性。

图1　AD-Apoptin的靶向复制能力分析

2.2AD55-Apoptin的安全性分析

分别用0.1、1.0、10.0MOI AD55-Apoptin感染L-02细胞或 Huh-7细胞96h，根据测量出的OD值计算细胞存活率，结果如图2。图2显示，AD55-Apoptin对肿瘤细胞株Huh-7的杀伤效果明显高于正常细胞株L-02，说明其安全性良好。

图2　AD55-Apoptin的安全性分析

2.3MTT分析不同处理组对肝癌细胞株Huh-7的体外抑制作用

分别用5、25、50、100 ng/mL的SNS-032处理Huh-7细胞，48、72、96h检测细胞存活率。分别用0.1、1.0、10.0MOI的病毒感染细胞，24、48、72、96 h后测量细胞存活率。根据两者单独作用的实验结果，选用10 MOI的病毒与100 ng/mL的化疗药物SNS-032联合处理Huh-7细胞，结果如图3。图3显示，SNS-032对肿瘤细胞的杀伤效果不是时间依赖而是剂量依赖的，选择合适的用药量，SNS-032可明显增强AD55-Apoptin对肝癌细胞株Huh-7的杀伤作用。

图3　MTT分析细胞存活率注：a)分别用浓度为5、25、50、100 ng/mL的SNS-032处理48、72、96 h后Huh-7细胞的存活率； b)分别用0.1、1、10 MOI的AD55-Apoptin处理24、48、72、96 h后Huh-7细胞的存活率；c)100 ng/mL的SNS-032或/和10 MOI的AD55-Apoptin处理24、48、72、96 h后Huh-7细胞的存活率，*P<0.05。

2.4MTT分析不同处理组对不同肿瘤细胞系的体外抑制作用

用10 MOI的病毒或/和100 ng/mL的化疗药物SNS-032联合处理肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7，胰腺癌细胞PANC-1，结肠癌细胞SW620及Huh-7细胞96 h。结果如图4所示，SNS-032对不同癌细胞均可不同程度增强AD55-Apoptin的抗癌作用，说明其对癌症治疗具有普遍意义。

图4　特异性分析

2.5Hoechst33342染色观察各处理组细胞核形态

各组处理Huh-7细胞48h后，加入Hoechst 33342避光染色30 min，之后在荧光显微镜下观察各组细胞核形态。从图5可以看出，单独用药组与联合用药组的Huh-7细胞都有不同程度的凋亡。

图5　Hoechst染色检测各处理组导致的Huh-7细胞凋亡注：箭头表示凋亡细胞，标尺为200μm。

2.6Annexin V/PI法检测Huh-7细胞早晚期凋亡

根据凋亡检测试剂盒说明，对Huh-7细胞的凋亡情况进行检测，检测结果见图6，图6(a)中右上象限与右下象限分别代表晚期凋亡与早期凋亡。将两象限显示的百分比加和即为发生凋亡的细胞比率，见图6(b),结果显示，SNS-032或AD55-Apoptin单独用药组凋亡率分别为10.5%和19.4%，联合用药组凋亡率为26.3%，与单独用药组相比有明显的提高。

图6　流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率

2.7Western Blot检测凋亡相关蛋白

为进一步研究SNS-032联合AD55-Apoptin是如何在分子水平上诱导Huh-7细胞凋亡的，本实验检测了凋亡相关蛋白的表达水平。如图7所示，联合用药组Caspase-3、8的表达量比各单独处理组明显增加，各单独处理组Caspase-3、8的表达量比Mock组明显增加；Caspase-7表达量与AD55-Apoptin单独处理变化不明显，SNS-032单独处理组Caspase-7表达量与Mock组相差也不明显；这说明SNS-032主要通过增加Caspase-8的表达量来促进肿瘤细胞凋亡，AD55-Apoptin主要通过增加Caspase-7,8的表达量来促进肿瘤细胞凋亡，二者联合使得下游Caspase-3表达量明显增加。此外，SNS-032联合AD55-Apoptin可显著增强PARP前体的剪切，下调抗凋亡蛋白XIAP的表达量，证明联合处理组可增强Huh-7细胞的凋亡，且具有更好的抗癌作用。

图7　Western Blot检测凋亡相关蛋白

3　讨　论

目前溶瘤病毒治疗肿瘤的研究已重视携带抗癌基因，以进一步提高其抗癌效果，并希望增强其安全性。癌症的靶向基因-病毒治疗策略是指通过生物技术手段改造病毒，增强其在肿瘤细胞内的靶向复制能力从而使肿瘤细胞裂解对其产生杀伤作用，且随着病毒的复制，其携带的抗癌基因也在肿瘤细胞内成千上万倍的复制，从而数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量[23]。本课题所用的AD55-Apoptin是本课题组在ZD55的基础上，将其天然E1A的启动子改造成肝癌特异性启动子AFP，从而提高其对肝癌的靶向性和安全性[24]，携带的抗癌基因Apoptin，可特异性引起肿瘤细胞凋亡，而不影响正常细胞。

化疗药物治疗作为目前肿瘤治疗中最有效的疗法之一，其优点是可以通过血液循环作用于全身，对扩散到全身各处的肿瘤细胞都有作用。若肿瘤细胞对该药物敏感，则其能取得良好的疗效。但在实际应用中发现，对所有肿瘤细胞都有良好治疗效果的化疗药物并不多，很多肿瘤细胞对化疗药物敏感度不高，在这种情况下，即使加大药量，延长用药时间，治疗效果并不理想，甚至会对人体产生强烈的毒副作用[25]。此外化疗效果有限，不能从根本上治愈且具有强烈的副作用，临床上应用的化疗药物常使癌症病人痛苦不堪。实验过程中我们观察到SNS-032能明显抑制Huh-7细胞生长并诱导其凋亡，且这种杀伤作用是剂量依赖的。

本实验利用CDK抑制剂SNS-032联合癌症的靶向基因-病毒治疗药物AD55-Apoptin处理肝癌细胞株Huh-7。携带Apoptin基因的溶瘤腺病毒AD55-Apoptin具有良好的靶向肿瘤细胞的能力，良好的生物安全性，MTT实验结果表明，联合用药对肝癌Huh-7细胞株的抑制作用要强于SNS-032或AD55-Apoptin单独用药，即使是对AD55-Apoptin不敏感的细胞株，联合用药组都在一定程度上强于单独用药组，流式结果表明SNS-032联合AD55-Apoptin可在更大程度上促进Huh-7细胞的凋亡。Western Blot实验从分子水平上证明了联合处理组可增强Huh-7细胞的凋亡，且具有更好的抗癌作用。本实验结果证明，SNS-032联合AD55-Apoptin具有更强的抗癌效果，且这种增强效应具有一定的广谱性，理论上可在降低用药剂量的同时达到相同甚至更好的效果，为病毒基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症奠定基础。

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(责任编辑： 许惠儿)

In-vitro Antitumor Effect of Combining CDK Inhibitor SNS-032 with AD55-Apoptin on Liver Carcinoma Cell Huh-7

SUNXiaozhu,LÜChunwei,QINYun,HANJiancui,WANGYigang

(College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

CDK Inhibitor SNS-032 and AD55-Apoptin were combined to treat Huh-7 to explore the in-vitro antitumor effect of the combination. MTT method was used to respectively detect inhibiting effects of SNS-032, AD55-Apoptin, the combination of SNS-032 and AD55-Apoptin on the growth of hepatoma cell line Huh7. The characteristic morphology of apoptosis cells were observed by Hoechst 33342 staining, flow cytometry was used to quantify the apoptosis, and Western Blot was used to detect the expression of apoptosis-related proteins. The results show that after treatment with the combination of 10MOI AD55-Apoptin and 100ng/mL SNS-032, the Huh-7 cell survival rate is only 4%, while in 10 MOI AD55-Apoptin and 100ng/mL SNS-032 separately treated cells, the survival rates are 60% and 8% (P<0.05) respectively. Hoechst 33342 staining, flow cytometry and Western Blot demonstrate that there are more apoptotic cells in the combined group. As shown in the experimental result, the combination of SNS-032 and AD55-Apoptin can effectively inhabit the growth of hepatoma carcinoma cell Huh-7 and induce it to get apoptotic.

cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor (SNS-032); AD55-Apoptin; liver carcinoma; in vitro; antitumor effect

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.03.022

2015-04-28

浙江省自然科学基金项目(LY13H080005)；浙江省科技计划项目(2014C37101)；浙江理工大学科研启动基金项目(14040365-J)

孙笑竹(1989-)，女，辽宁锦州人，硕士研究生，主要从事癌症的靶向基因-病毒疗法方面的研究。

王毅刚，E-mail：ygwang@zstu.edu.cn

Q26

A

1673- 3851 (2016) 02- 0290- 07 引用页码： 030704