鲮鱼加工下脚料的酶解工艺优化

瞿叶辉，岑小燕，丁利君,*，黄金，成晓玲（.广东工业大学轻工化工学院，广东广州50006；.广东工业大学材料与能源学院，广东广州50006）

鲮鱼加工下脚料的酶解工艺优化

瞿叶辉1，岑小燕1，丁利君1,*，黄金2，成晓玲1
（1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州510006；2.广东工业大学材料与能源学院，广东广州510006）

以鲮鱼糜等加工的下脚料鱼头、鱼骨、鱼尾等为原料，选用中性蛋白酶对其进行水解，通过响应面分析优化酶解条件。以水解度、多肽含量为指标，分别对酶浓度、温度、pH值、料液比、酶解时间等因素对水解效果的影响进行分析。结果表明：中性蛋白酶水解鲮鱼加工下脚料的最佳条件为：酶浓度5.1 mg/g，料液比1∶5（g/mL）、自然pH、温度55.16℃、酶解5.22h，在此条件下得到的水解度为13.01%，多肽含量为1.07mg/mL。

鲮鱼下脚料；响应面；多肽含量；水解度

鲮鱼（Cirrhinus molitorella）主要产地在中国，在水温较高如珠三角、海南等地区较为常见，养殖成本低、产量大［1］。在营养价值方面，鲮鱼含有丰富的蛋白质、维生素A、钙、镁、硒等，具有很高的营养价值和药用价值［2］。鱼类下脚料中含有丰富的蛋白质、矿质元素等，将鱼类下脚料深加工，有利于提高鱼类资源利用率，提高经济效益［3］。而目前鱼品下脚料可以通过精加工制成可溶性食用鱼类蛋白粉、鱼皮胶、鱼骨糊、鱼蛋白钙糖等，这些产品可以作为氨基酸强化剂，也可以开发特殊风味的鱼味调味剂［4］，或制成具有生物活性如抗氧化性、降血压的多肽［5］。目前处理鱼下脚料用的较多的是生物酶解法，将鱼蛋白降解成小分子多肽及氨基酸，有利于人体的吸收利用［6-7］。邓敏［8］等利用响应面对酶解罗非鱼制取多肽进行了很好的优化，钱清华等［9］利用响应面优化了酶解带鱼蛋白的工艺。本研究为了提高鲮鱼加工下脚料的利用率，用中性蛋白酶对其进行水解，通过响应面优化酶解条件，为后续鲮鱼下脚料的研究提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鲮鱼下脚料（头、骨、尾）：购于广州市番禺区清河综合市场；中性蛋白酶（5×104U/g）：南京奥多福尼生物科技有限公司；还原型谷胱甘肽标准品：sigma公司；浓硫酸，硼酸，盐酸，磷酸二氢钠，甲醛，氢氧化钠，三氯乙酸，磷酸氢二钠，中性红，百里酚酞，乙酸镁，无水乙醚等：均为分析纯。

UV-1200型分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.2鲮鱼下脚料基本成分分析

粗蛋白含量的测定：凯氏定氮法（GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》）；脂肪含量的测定：索氏抽提法（GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》）；水分含量的测定：150℃恒重法（GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》）；灰分含量的测定：550℃灼烧法（GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》）。

1.3水解度及多肽含量的测定

1.3.1水解度的测定

水解度的测定采用甲醛滴定法［10］。

式中：V1为空白消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V2为滴定样品消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL；C氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；M所取水解液的体积，mL。

1.3.2多肽含量的测定

参考鲁伟［11］等人的方法绘制标准曲线，测定多肽含量。由标准曲线得回归方程：Y=0.115X+0.002286，R2=0.995。

1.4鲮鱼下脚料的酶解工艺

鲮鱼下脚料→清洗→高压蒸煮→粉碎→生物酶解解→灭酶→离心→上清液

1.5酶解条件的确定

选取酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH、料液比5个单因素，以水解度、多肽含量为考察指标，确定对酶解效果较显著的因素及水平。在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken-Design响应面优化设计，以水解度及多肽含量为响应值［12］。

2　结果与分析

2.1鲮鱼下脚料基本成分分析

鲮鱼下脚料成分分析如表1所示。

由表1可知，新鲜鲮鱼加工下脚料含有大量水分，达67.55%，蛋白质的含量高达19.19%，说明鲮鱼下脚料是一种不可忽视的优质蛋白质资源，可应用于多肽产品的开发及利用。

表1 鲮鱼下脚料成分分析Table 1　Proximate analysis of Cirrhinus molitorella waste

2.2酶解鲮鱼下脚料的单因素试验

2.2.1酶浓度对酶解效果的影响

称取样品2 g，100℃灭酶后冷却，分别配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL 8个梯度的酶溶液，在pH 7.0、温度50℃、料液比1∶5（g/mL）的条件下酶解2 h，以水解度（DH）及多肽含量（PC）为指标，探讨不同酶浓度对酶解效果的影响。酶浓度对酶解效果的影响如图1所示。图1表明，当酶浓度从0到0.2 mg/mL时，水解度与多肽浓度上升速度非常快，当酶浓度升高时，水解度呈现出一个先升后降的趋势，在浓度在1.0 mg/mL时，水解度达到最大。因此确定本反应中最适酶浓度为1.0 mg/mL。

2.2.2酶解时间对酶解效果的影响

称取样品2 g，100℃灭酶后冷却，在酶浓度1 mg/ mL、pH 7.0、温度50℃、料液比1∶5（g/mL）的条件下，分别酶解0、1、2、3、4、6、8、10 h，分析不同酶解时间对酶解效果的影响。酶解时间对酶解效果的影响如图2所示。由图2可知，在一定时间范围内，随着酶解时间的增加，水解度和多肽含量均有所上升，当超过4 h后，水解度呈现一个下降的趋势，而多肽含量在6 h时达到最大值并维持在一个稳定的数值上。

2.2.3酶解温度对酶解效果的影响

称取样品2 g，100℃灭酶后冷却，以酶浓度1 mg/ mL、pH 7.0、料液比1∶5（g/mL）为固定条件，分别在室温（22℃）、30、35、40、45、50、55、60℃的条件下酶解2 h，分析不同酶解温度对酶解效果的影响。酶解温度对酶解效果的影响如图3所示。图3可以看出，随着温度的升高，水解度与多肽含量产生一个先升后降的趋势，当温度为55℃时，水解度达到最大，而多肽含量在温度为50℃达到最大。

2.2.4pH对酶解效果的影响

称取样品2g，100℃灭酶后冷却，以酶浓度1mg/mL、温度50℃、料液比1∶5（g/mL）为固定条件，分别在pH值为自然（7.3）、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的条件下酶解2 h，研究不同pH环境对酶解效果的影响。pH值对酶解效果的影响如图4所示。由图4可以看出，随着初始pH值的增加，水解度和多肽含量都是先增大后减小，在pH值等于7.0时达到最大。当溶液初始pH值超过7.0后，水解度与多肽含量都有所下降，因此中性蛋白酶的最适pH值在7.0左右。

2.2.5料液比对酶解效果的影响

称取样品2 g，100℃灭酶后冷却，以酶浓度1 mg/ mL、温度50℃、pH 7.0为固定条件，分别在料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10（g/mL）的条件下酶解2 h，探讨不同料液比对酶解效果的影响。料液比对酶解效果的影响如图5所示。图5表明，随着料液比的增大，水解度和多肽含量均呈现一个先升后降的趋势，但是总的来说，料液比对酶解效果影响不大虑到能源以及经济等因素，选择1∶5（g/mL）的料液比作为酶解条件的最优料液比。

图1 酶浓度对酶解效果的影响Fig.1　Influence of enzyme concentration to hydrolysis

图2 酶解时间对酶解效果的影响Fig.2　Influence of enzyme time to hydrolysis

图3 酶解温度对酶解效果的影响Fig.3　Influence of enzyme temperature to

图4pH对酶解效果的影响Fig.4　Influence of enzyme pH to hydrolysis

图5　料液比对酶解效果的影响Fig.5　Influence of solid-liquid ratio to hydrolysis hydrolysis

2.3响应面试验结果与分析

综合单因素试验结果，选择酶浓度、温度、时间对酶解效果有显著影响的因素，进行Box-Behnken-Design响应面优化设计，结果如表1。采用Design-Expert对试验结果进行方差分析（ANOVA），利用Design-Expert软件对表1的结果进行多元回归拟合，获得响应的回归方程为：

方差分析结果（表2）表明，以水解度为指标，模型P值等于0.0022，表明该模型高度显著，而模型的失拟性P值为0.6003＞0.05，而以多肽含量为指标，模型P值等于0.0006，表明该模型高度显著，而模型的失拟性P值为0.3509＞0.05，说明模型与实际情况拟合情况良好，可以使用该模型对实际试验进行预测和分析。影响酶解液中水解度的因素顺序为：时间C＞酶浓度A＞温度B；影响酶解液中多肽浓度的因素顺序为酶浓度A＞时间C＞温度B。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2　Scheme of response surface analysis and test results

表3方差分析Table 3　Analysis of variance

各因素对酶解鲮鱼下脚料水解度的影响如图6所示。各因素对酶解鲮鱼下脚料多肽含量影响的响应面图如图7所示。

图6　各因素对酶解鲮鱼下脚料水解度的影响Fig.6　Influence of different factors to the degree of hydrolysis of Cirrhinus molitorella waste

图7　各因素对酶解鲮鱼下脚料多肽含量影响的响应面图Fig.7　Influence of different factors to the peptide content of Cirrhinus molitorella waste

［1］王琳，张慜，刘亚萍.即食鲮鱼饼的加工工艺［J］.食品与生物技术学报，2014，33（3）：288-292

［2］周燕芳，詹丽虹.鲮鱼蛋白酶解条件的研究 ［J］.江苏农业科学，2010（2）：312-314

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［7］BOUGATEF A，NEDJAR-ARROUME N，MANNI L，et al.Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle（Sardinella aurita）by-products proteins ［J］.Food Chemistry，2010，118（3）：559-565

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Optimization of Enzymolysis of Cirrhinus molitorella Waste with Response Surface Methodology

QU Ye-hui1，CEN Xiao-yan1，DING Li-jun1，*，HUANG Jin2，CHENG Xiao-ling1
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Materials and Energy，Guangdong University of Technology，Guangzhou，510006，Guangdong，China）

The head，bones，other raw waste of Cirrhinus molitorella were hydrolyzed by neutral protease，and response surface analysis method were used to optimize the enzymatic processes.The enzyme concentration，temperature，pH，solid to liquid ratio，time and other factors are discussed to analyze the effect of hydrolysis based on the degree of hydrolysis and peptide content.Three main factors and its three levels were chose recording to single factor test，then the experiment was based on the response surface design principles and Design-Expert software was used to analysis and validation.The results showed that：the optimum conditions of neutral hydrolysis：enzyme concentration5.1 mg/g，temperature55.16℃，time5.22 h，pH natrural，solid-liquid ratio 1∶5 （g/mL），the degree of hydrolysis and the peptide content is 13.01%and 1.07 mg/mL seperately in this condition.

Cirrhinus molitorella waste；response surface methodology；peptide；hydrolysis

2015-09-17

广东省教育部产学研合作重大专项（2013A090100009）

瞿叶辉（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工。

丁利君（1965—），女（汉），教授。