响应面分析法优化蛹虫草菌糠多糖提取工艺的研究

姜慧明，杨　红，吕国忠，孙晓东，滕　聪

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605)



响应面分析法优化蛹虫草菌糠多糖提取工艺的研究

姜慧明，杨红，吕国忠，孙晓东，滕聪

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605)

以蛹虫草(Cordycepsmilitaris)菌糠为材料，进行菌糠多糖提取条件的优化研究。单因素实验表明，提取温度、水料比及提取时间均不同程度地影响多糖提取率。根据Box-Behnken中心组合实验设计原理对提取温度、水料比、提取时间进行三因素三水平试验设计，采用响应面软件Design-Expert进行处理，获得蛹虫草菌糠多糖提取最佳的优化条件。即提取温度100 ℃，水料比50∶1，提取时间3 h 优化条件下多糖提取率达5.45 %, 多糖提取预测值为5.88 mg·mL-1。建立的模型拟合度较好，可用来对蛹虫草多糖提取工艺的分析和预测。

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)；菌糠；多糖；响应面分析

蛹虫草(Cordycepsmilitaris(L) Link.)球壳目、麦角菌科、虫草属。蛹虫草多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种生物活性功能[1]。菌糠是食用菌栽培收货后的培养基剩余物，其中含有丰富的氨基酸、菌类多糖、Fe、Ca 、Zn、Mg等微量元素及一些食用菌生长的代谢产物，是一种可再生利用的生物资源。近年来，对菌糠的利用已经开展了一些有益的探索。如Zhu[2]等从食用菌中筛选抗细菌物质；Williams等[3]利用菌糠发酵制备燃料沼气；Sochtig等[4-6]利用菌糠加工有机肥用于园艺和食用菌的生产；刘兆伟等[7]成功地利用菌糠生物降解有害物质，借助改性食用菌菌糠吸附重金属离子，以食用菌菌糠为原料聚合合成多种菌糠基复合高吸水树脂[8]等。从废弃菌糠中提取多糖已成为食用菌菌糠的再次开发与利用的研究热点之一。

本研究选用以大米为主要基质的蛹虫草菌糠(主要成分大米81.2 %、蚕蛹粉1.8 %、黄豆9.7 %，白糖5.4 %、KH2PO40.8 %、MgSO40.8 %、VB10.3 %)为材料，利用水提法提取蛹虫草菌糠多糖，并对不同条件下提取的多糖含量进行测定比较。

1　材料与方法

1.1材料

蛹虫草菌糠采集于大连普兰店谢屯蛹虫草种植地。

1.2仪器及试剂

RE-52旋转蒸发器(上海研承仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；Sorvall Evolution RC高速落地离心机(赛默飞世尔科技); UV 2100紫外可见分光分度计(河南兄弟仪器设备有限公司); DH27-9053A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒); HH-S21-6-S水浴锅(上海市百典仪器厂);PL303电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多); 80目标准筛。

主要试剂为氯仿、三氯甲烷、茚三酮、浓硫酸、蒽酮、正丁醇、葡萄糖、碘液。

1.3方法

1.3.1原料预处理

将蛹虫草菌糠用木槌打碎至黄豆粒大小，放入鼓风干燥箱中干燥，在50 ℃的条件下烘干至恒重。粉碎机粉碎后再过80目筛，样品存放至干燥处备用。

1.3.2葡萄糖标准曲线的制作

将100 mg 葡萄糖置于100 mL 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，以去离子水补至2.0 mL。称取0.1 g蒽酮至烧杯中，加入80 %浓H2SO4100 mL溶解，摇匀，备用。每只试管中加入蒽酮-浓硫酸试剂6 mL，混匀，静置冷却至室温，沸水浴加热15 min，迅速置于冰水中冷却15 min。以空白为对照，在625 nm下测吸光值。以吸光值为纵坐标、标准葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3蛹虫草多糖提取条件的优化

在不同提取温度、时间和水料比处理条件下浸提后，离心获上清液。将上清液稀释20倍，取1 mL，加入3 mL蒽酮浓硫酸试剂摇匀，静置20 min后，在625 nm下测不同处理条件下的吸光值。

1.3.4蛹虫草多糖的纯化

利用Sevage 法[1]对每份多糖溶液做5次去蛋白处理,留上层溶液备用。

加蒸馏水溶解优化条件下获得的多糖,经5次去蛋白处理后,向获得的上层溶液中加入4倍体积的95 %乙醇，经醇析过夜沉淀处理获得多糖；再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤2次，室温下干燥后获得纯化的虫草粗多糖，称重后计算多糖分离率。

蛋白质检测方法采用茚三酮法。具体方法：取待检的多糖溶液1 mL，向其中滴加2～3 滴茚三酮溶液，观察是否有蓝色出现[6]。

1.3.5单因素实验

提取时间:称取10 g蛹虫草菌糠放入250 mL三角瓶中，加去离子水200 mL，摇匀后分别在100 ℃水浴加热2，3，4，5，6 h，冷却，6 000 r·min-1离心10 min，获上清液，稀释20倍后量取1 mL，再加入蒽酮浓硫酸试剂3 mL，摇匀，室温下放置20 min，在625 nm下测吸光值，对照标准曲线得多糖含量。

水料比：称取蛹虫草菌糠5 g，分别按照10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1水料比(mL·g-1,下同)加去离子水，摇匀后在100 ℃水浴锅中加热4 h，测多糖含量。

提取温度：称取10 g蛹虫草菌糠放入250 mL三角瓶中，加入去离子水2 000 mL，摇匀，分别在40，50，60，70，80，90，100 ℃条件下水浴4 h，测多糖含量。

1.3.6正交试验设计

根据Box-Behnken中心组合试验设计法，结合三个单因素水平的实验结果，分别对多糖提取有显著影响的温度、水料比、时间的三水平三因素响应面分析方法进行实验。因素与水平见表1。

表1　响应面实验因素及水平

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.2.1提取温度对多糖含量的影响

提取温度与多糖质量分数的关系如图1。由图1可知，多糖质量分数随着提取温度的升高而呈现上升趋势，当提取温度升至100 ℃时，多糖质量分数达到最高，并趋于平缓。

图1　提取温度与多糖质量分数的关系

2.1.2提取时间对多糖含量的影响

提取时间与多糖质量分数的关系如图2。由图2可知，依据2.1.1的结果，100 ℃下提取多糖，多糖质量分数随着提取时间的延长，呈现先高后低的趋势，当提取时间达到4 h 时，多糖的质量分数达到最高。

图2　提取时间与多糖质量分数的关系

2.1.3水料比对多糖含量的影响

水料比与多糖质量分数的关系如图3。由图3可知，多糖质量分数随着水比例的增加，呈现先高后低的趋势，当水料比为40∶1 时多糖质量分数达到最高。

图3　水料比与多糖质量分数的关系

2.2响应面试验分析

2.2.1响应面分析蛹虫草多糖提取方案与结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计法以及温度、水料比、时间的三水平三因素进行了响应面分析，结果见表2。

表2　响应面分析蛹虫草菌糠多糖提取工艺方案及结果

2.2.2蛹虫草多糖提取回归方程的建立及试验分析

表3　响应面二次模型及其回归系数的方差分析结果

2.2.3响应曲面和等高线分析

响应面是根据回归方程绘制的呈现各试验因素相互作用关系的三维空间曲面，可以检验变量的响应值大小,明确变量的相互关系。根据等高线图和响应面，观察拟合响应面的形状及特点，分析提取时间、温度和水料比对多糖提取率的影响如图4、图5、图6。

等高线图可以较直观地反映各因素对响应值的影响，方便分析各参数之间的相互作用。由图4可以看出，提取时间和提取温度交互作用不明显，等高线沿着X2方向(提取时间)变化较快，而沿X1方向(提取温度)变化不明显，在试验水平下，提取时间较提取温度对响应值的影响显著。在提取温度和水料比的交互作用中，提取温度(X1)对响应值的影响比水料比(X3)显著(如图5)。由图6可以看出，提取时间与水料比交互作用也不显著，表现为曲线平滑，在试验水平下，提取时间和水料比对响应值的影响差异不大。

图4　提取时间和提取温度交互作用的响应面和等高线

图5　提取温度和水料比交互作用的响应面和等高线

图6　提取时间和水料比交互作用的响应面和等

3　结　论

通过对蛹虫草菌糠多糖提取时间、提取温度、水料比三个单因素试验设计，并且针对这三个因素水平的响应面进行分析，得到优化的蛹虫草菌糠多糖的最佳提取工艺为100 ℃， 3 h， 50∶1，此时多糖提取预测值为5.88 mg·mL-1。该优化工艺对蛹虫草菌糠多糖提取具有一定的实践指导意义。

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[8] 程志强. 菌糠基复合高吸水树脂的制备及性能研究[D]. 长春：吉林大学化工学院, 2013.

(责任编辑邹永红)

Extraction Optimizing of Polysaccharide from Waste Materials ofCordycepsmilitarisby Response Surface Analysis Method

JIANG Hui-ming, YANG Hong, LV Guo-zhong, SUN Xiao-dong, TENG Cong

(School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials ofCordycepsmilitaris. The single-factor experiment results showed that three factors including the extraction time, water-materials ratio, and extraction temperature of the experiment would affect the extraction degree. According to Box-Behnken central composite design principle, three factors and three levels experiments are designed, and optimal conditions of extraction of polysaccharides are obtained. Response surface processing software Design-Expert was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 100 ℃, time of 3 h, water-material ratio of 50∶1. The extraction rate of polysaccharide was 5.45 % and predictive value of polysaccharide was 5.88 mg/mL. The model fit well, which can be used to analyze and predict the extraction process of polysaccharide fromCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; waste material; polysaccharide; response surface analysis

2096-1383(2016)05-0462-04

2016-07-07；最后

2016-07-25

姜慧明(1972-)，男，山东莱阳人，副教授，博士，主要从事化学研究。

杨红(1978-)，女，辽宁海城人，副教授，博士，主要从事食用菌研究，E-mail：yanghong@dlnu.edu.cn。

S646

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