醋糟发酵红酵母产类胡萝卜素的研究

郑洛昀，辛嘉英，王　艳，邓永平，么婷婷

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨　150076）

醋糟发酵红酵母产类胡萝卜素的研究

郑洛昀，*辛嘉英，王艳，邓永平，么婷婷

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

以醋糟为原料，用酶解法和酸解法对醋糟进行水解产生还原糖，用单因素试验和L9（34）正交试验优化了酶解条件和酸解条件，最终得到酶解还原糖产率为33.89%，酸解还原糖产率为39.46%；用范氏法对其纤维素进行测定，用水解后的醋糟培养红酵母，以醋糟直接培养红酵母为对照；得到醋糟酶解后发酵红酵母产类胡萝卜素达到19.94 mg/g，酸解醋糟后培养红酵母产类胡萝卜素达到17.61 mg/g。经分析及数据处理得出，相对于酸解和直接在醋糟上培养红酵母，酶解法较好些。

醋糟；红酵母；水解；发酵；还原糖

0　引言

废弃的醋糟是谷物固态发酵产醋的副产品。我国是产醋大国，每年食醋生产企业有200×104t醋糟的产生［1］。目前，醋糟利用方式主要是作为饲料和培养基原料［2］，作为饲料醋糟在反刍动物和草食动物饲料中主要直接用于配制动物日粮、替代部分其他饲料，以降低成本。杨致玲等人［3］着重分析了醋糟中一些常见的营养成分，得到醋糟中的粗蛋白含量约11.45%，粗脂肪12.78%，粗纤维29.63%，粗灰分14.6%，钙0.42%，磷0.19%。醋糟中蛋白质、淀粉含量较低，而粗纤维含量较高，工业上可回收利用。醋糟直接饲喂动物，适口性较差，且其营养物质利用率太低。醋糟中纤维素结构紧密，微生物难以降解［4］。因此，水解是含纤维资源开发利用的关键步骤之一。而硫酸水解法和酶降解法是目前纤维质原料糖化常用的方法，酸解可以直接将木质纤维素水解产生单糖，也可作为酶解的预处理方法，而且具有较好的可操作性和经济可行性。饲用酶制剂可以降低饲料黏度，显著提高动物对饲料的消化能力，提高饲料的消化率和利用率；而且酵母菌细胞蛋白质含量高，是生产富含蛋白质的饲料的常用菌株。

目前，红酵母的应用已非常广泛，它常被作为一种极为有效增色剂用于禽类，例如使鸡、鸭的蛋黄颜色加深等。本文主要在醋糟上培养红酵母产类胡萝卜素，从而改变饲料适口性和提高饲料营养价值。

1　材料与方法

1.1材料

红酵母AS2.2241，选自哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室。

醋糟，哈尔滨正阳河醋厂提供。

1.2主要仪器

SPX-100B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；QE-2型台式恒温摇床，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；ESJ 180-4型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；HW SY11-K型电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司产品；TGL-16G型台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；AR1140型电子分析天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司产品；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计，龙尼柯（上海）仪器有限公司产品；DF-1型集热式磁力搅拌器，常州丹瑞实验设备有限公司产品；旋转蒸发仪，德国IKA公司产品。

1.3主要试剂及配制

（1）酶。酸性纤维素酶（酶比活150 000 kg）、硫酸（分析纯）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂、丙酮、DNS试剂、中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）、酸性洗涤剂（2%十六三甲基溴化铵）、氢氧化钠、酸洗石棉、95%乙醇（化学纯）、乙醚（化学纯）、正辛烷（分析纯）、十氢化萘。

（2）中性洗涤剂。准确称取18.6 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA，分析纯）和6.8 g硼酸钠（分析纯）放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30 g十二烷基硫酸钠（分析纯）和10 mL乙二醇乙醚（分析纯）；再称取4.56 g无水磷酸氢二钠（分析纯）置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释至1 000 mL，其中pH值约为6.9～7.1（pH值一般勿需调整）；硫酸：量取约27.87 mL浓硫酸（分析纯，比重1.84，98%），徐徐加入已装有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后注入1 000 mL容量瓶中定容，标定。

（3）酸性洗涤剂（2%十六烷三甲基溴化铵）。称取20 g十六烷三甲基溴化铵（CTAB，分析纯）溶于1 mol/L硫酸，必要时过滤。

（4）3，5-二硝基水杨酸试剂。称取6.3 g 3，5-二硝基水杨酸，量取262 mL 2 mol/L NaOH溶液，将其加入预热的含有185 g酒石酸钾钠溶液（500 mL）中，搅拌均匀后准确加入6.25 mL苯酚和5 g Na2SO3，搅拌使其充分溶解。待其完全冷却，转移至1 000 mL的棕色容量瓶中，加水定容，保存备用。

1.4红酵母液体种子培养

用适量无菌水将菌苔洗下，吸取1 mL接种于含有50 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，于30℃，150 r/min条件下振荡培养48 h。

2　试验及测定方法

2.1试验方法

2.1.1醋糟酶解条件的优化

准确称取10 g干醋糟于250 mL的三角瓶中，添加不同量的酸性纤维素酶、不同量的蒸馏水，把装好的三角瓶于摇床（转速为150 r/min）中分别以不同酶解温度、不同酶解时间下进行酶解。以还原糖产率为指标，确定最佳单因素进行正交分析，确定酶水解醋糟产还原糖的最优条件。酶解后，在沸水浴上灭酶15 min以上，迅速冷却，离心后取适量上清液于紫外分光光度计测还原糖吸光度，计算还原糖含量。把测完样品倒回三角瓶，为培养红酵母菌种备用。

2.1.2醋糟酸解条件的优化

准确称取10 g干醋糟于250 mL的三角瓶中，将转子放在三角瓶内，分别以不同硫酸浓度、不同固液比，将其于水浴锅中以不同酸解时间、不同酸解温度为单因素进行酸解；以还原糖产率为指标，确定最优因素；做正交试验分析，得到酸水解产还原糖的最优条件。然后用3 mol/L的NaOH调节pH值至中性，备用。

2.1.3红酵母菌在醋糟中的培养

用灭菌后的移液管准确吸取1 mL（约1×107个）红酵母菌液于水解后的醋糟中，于28℃下培养48 h，经45℃烘干后测定类胡萝卜素含量。

2.2测定方法

2.2.1还原糖及含量的测定——DNS法

配制2 mg/mL的溶液适量混匀，分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL葡萄糖液于6支试管，加蒸馏水1.8，1.6，1.4，1.2，1.0 mL，再向1～5号试管中分别加入2 mL DNS溶液。各试管充分混合均匀，置于沸水浴5 min，迅速冷却，定容至25 mL，振荡使其混合均匀。以不加葡萄糖的蒸馏水为对照，分别测定1～5号试管于540 nm波长下的吸光度。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，并用最小二乘法进行回归得到回归方程Y=0.037X+ 0.061，其中Y为OD540，R2=0.997 1。

2.2.2酵母细胞破碎方法——酸热破壁法

用蒸馏水将烘干至恒质量的酵母细胞移至45 mL离心管，以转速5 000 r/min离心10 min，去上清液，吸取10 mL盐酸（3 mol/L） 加入湿菌体中，振荡45 min使其充分混匀，置于100℃沸水中加热5 min，快速取出后冷却。

2.2.3类胡萝卜素的提取——丙酮提取法

将经（1.4）处理后的菌体，以转速5 000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀洗涤2次，并用吸水纸吸去多余水分。吸取15 mL丙酮加至沉淀中，于30℃条件下振荡提取20 min，以转速9 000 r/min离心15 min，取上清液。如提取不充分，再加适量丙酮进行提取，直至菌体呈现无色。合并上清液，适当稀释后用WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计测定其于波长475 nm处吸光度。按下式计算类胡萝卜素产量：

式中：Aλmax——色素最大吸收波长处的吸光度；

D——测定试样的稀释倍数“1”；

V——提取色素用有机溶剂体积，mL；

W——发酵液体积，mL；

0.16——类胡萝卜素的摩尔消光系数，L/（mg·cm）。

在上式中W指发酵液体积，则计算结果单位是μg/mL，即mg/L。

2.2.4纤维素的测定方法——范氏（Van Soest）法

纤维素的测定按照范氏（Van Soest）中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维的方法测定［5］。

3　结果与讨论

3.1单因素试验结果与分析

（1） 还原糖含量的测定。根据2.2.1的操作步骤，采用DNS法测定不同葡萄糖质量浓度下的吸光度A，其中Y=0.037X+0.061，R2=0.997 1。

DNS法测定还原糖标准曲线见图1。

图1　DNS法测定还原糖标准曲线

（2）固液比的确定。取纤维素酶0.55 g，酶解温度50℃，在摇床中振动酶解48 h。

固液比对还原糖产率的影响见图2。

由图2可知，在一定范围内，还原糖产率随固液比增大而增加，当固液比为1∶5时达到最大，其后还原糖产率逐渐降低，可能是由于固液比增大纤维素酶浓度降低，纤维素酶与醋糟结合率变小的缘故，所以最佳固液比为1∶5。

图2　固液比对还原糖产率的影响

（3）酶用量的确定。

酶用量对还原糖产率的影响见图3。

图3　酶用量对还原糖产率的影响

由图3可知，还原糖产率随酶用量的增加而增加，当酶用量达到0.65 g时还原糖产率达到最大；随后还原糖产率有所下降，这可能是因为许多酶在底物浓度超过一定限度时反应速度减弱，纤维素酶接近饱和，所以最佳酶用量为0.65 g。

（4）酶解温度的确定。

酶解温度对还原糖产率的影响见图4。

图4　酶解温度对还原糖产率的影响

由图4知，还原糖产率随酶解温度的升高，还原糖产率平缓升高，当到50℃后还原糖产率迅速下降，原因可能是由于酶解温度过高，对酶反应有抑制作用，并且酶解温度过高导致纤维素酶失活，从而还原糖产率迅速下降，所以最优酶解温度为50℃。

（5）酶解时间的确定。

酶解时间对还原糖产率的影响见图5。

由图5可知，醋糟随着酶解时间的变长，还原糖产率逐渐增多，当48 h时达到最大，随着酶解时间延长，还原糖产率下降，可能是因为随酶解时间的延长，底物浓度降低，产物浓度过高会对水解反应产生抑制作用。所以，当酶解时间48 h，固液比1∶5，酶用量0.65 g，酶解温度50℃，还原糖产率最多为33.1%，确定最适酶解时间为48 h。

图5　酶解时间对还原糖产率的影响

通过对单个因素的分析，确定较好的发酵条件，然后利用正交试验分析方法，进行正交试验。

3.2酶解正交试验结果

为了进一步优化酶解条件，设计L9（34）正交试验，以确定最优条件。

正交试验结果见表1。

表1　正交试验结果

由表1可知，各因素对酶解的影响大小次序为B＞A＞D＞C，优选方案为 A2B2C3D3，该组合并不在9次试验中，所以对其进行验证。结果显示，在最佳组合条件下，酶解还原糖产率为33.89%；综合考虑极差分析结果，最佳优选方案为A2B2C3D3，即酶解温度50℃，酶用量0.65 g，固液比1∶5，酶解时间48 h。通过验证试验，此结果正确。

3.3酸解因素优化及分析

3.3.1酸解单因素水平的确定

（1）硫酸浓度的确定。

硫酸浓度对还原糖产率的影响见图6。

由图6可知，酸解过程中，随着硫酸浓度的不断增加，样品中还原糖产率先增加后下降，可能是因为硫酸达到一定浓度时，一些已经溶解的醋糟又炭化而出现沉淀；并且加大硫酸浓度使得醋糟颜色加深，高浓度的硫酸还会对环境造成污染。所以，硫酸浓度为8%时还原糖产率最高。

图6　硫酸浓度对还原糖产率的影响

（2）固液比的确定。

底物与硫酸的比例对还原糖产率的影响见图7。

图7　底物与硫酸的比例对还原糖产率的影响

由图7可知，随着固液比的增加，醋糟中纤维素的降解增大，还原糖产率也随之变大；当固液比为1∶10时达到最大，随后降低。分析原因，可能是硫酸过多水解液中的还原糖产率降低。综合考虑，当固液比为1∶10时最佳。

（3）酸解时间的确定。

酸解时间对还原糖产率的影响见图8。

图8　酸解时间对还原糖产率的影响

由图8可知，随酸解时间变长，当到60 min时，还原糖产率达到最大。酸解过程中，随着酸解时间的不断延长，还原糖产率先升高后降低，然后趋于平缓。分析其原因，可能是由于醋糟长时间在水浴锅中，其纤维素已经完全降解。

（4）酸解温度的确定。

酸解温度对还原糖产率的影响见图9。

由图9可知，酸解过程中，随着酸解温度的不断升高，还原糖产率逐渐增高，并且于120℃时还原糖产率最高。分析其原因，可能是高温的条件下醋糟中有部分难以分解的物质发生分解，使得酸解更完全、更彻底。

图9　酸解温度对还原糖产率的影响

通过对单个因素的分析，确定较好的发酵条件，然后利用正交试验确定最优方案。

3.3.2酸解正交试验结果

为了进一步优化酸解条件，设计L9（34）正交试验，以确定的最优条件。

正交试验结果见表2。

表2　正交试验结果

由表2可知，各因素对酸解的影响大小次序为D'＞B'＞C'＞A'，优选方案为A'2B'2C'2D'1，该组合并不在9次试验中，所以对其进行验证。结果显示，在最佳组合条件下，酸解还原糖产率为39.46%；综合考虑极差分析结果，最佳优选方案为A'2B'2C'2D'1，即硫酸浓度8%，固液比1∶10，酸解时间60 min，酸解温度120℃。通过验证试验，此结果正确。

3.4纤维素的测定及比较分析

参照2.2.4的方法，对几种纤维素进行测定。

不同水解方法醋糟中纤维素及灰分的比较见表3。

由表3可知，醋糟酶解后CF，ADF，DNF分别降低了5.63%，11.4%，25.41%，醋糟酸解后CF，ADF，DNF分别降低了6.81%，37.1%，47.54%，同时灰分也有所减少。由还原糖产率的增长纤维素含量的降低，可知有部分纤维素转化成了还原糖。

表3　不同水解方法醋糟中纤维素及灰分的比较 /%

3.5醋糟培养红酵母各指标的测定及比较分析

按接菌量1×107个/瓶，于28℃条件下培养48 h，置于45℃条件下烘干后测定类胡萝卜素含量，以未接菌的醋糟培养基为对照。测定类胡萝卜素含量参照1.3.2和1.3.3的测定步骤。

产类胡萝卜素的比较见表4。

表4　产类胡萝卜素的比较

由表4可知，酸解醋糟产还原糖比酶解产还原糖要多，但是在接菌量一样的情况下，酶解醋糟后比酸解醋糟后培养红酵母产类胡萝卜素要多。分析原因，可能是在酸解过程中，由于硫酸浓度过高，破坏了醋糟中的其他利于红酵母生长的成分，至使红酵母生长情况不好。

4　结论

通过优化得到，酶解最佳反应条件下产还原糖33.89%，类胡萝卜素产量为19.94 mg/g；酸解醋糟产还原糖39.46%，类胡萝卜素产量为17.61 mg/g。综合考虑，酸解过程中需要较高的温度，并且操作较复杂；而酶解反应比较温和，且简单易操作，并且适合大批量工业生产。相对比较下，酶解醋糟培养红酵母产类胡萝卜素要比酸解产类胡萝卜素要好。

［1］Wang Z H，Dong X F，Tong J M，et al.Waste vinegar residue as substrates for phytase production by Aspergillus ficuum［J］.Waste Management Res，2009（4）：1-8.

［2］杨庆文，彭晓光，杨林娥，等．醋糟的开发与利用 ［J］．山西农业科学，2009，37（2）：44－46．

［3］杨致玲，李建英，张栓林.微生物发酵可提高醋糟营养价值 ［J］.中国饲料，1999（6）：24-26.

［4］张福元，阎永亮，吴海花，等.猴头菇醋糟高产配方筛选及其发酵条件研究 ［J］.食用菌学报，2002（1）：28-30.

［5］杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术 ［M］.北京：中国农业大学出版社，1993：58-62.◇

Production Carotenoids from Vinegar Residue by Rhodotorula

ZHENG Luoyun，*XIN Jiaying，WANG Yan，DENG Yongping，YAO Tingting
（Food and Engnineering College，Harbin Vniversity of Commerce，Key Laboratory of Food Science and Engineering Colleges and Vniversities in Heilingjiang Province，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

This study use vinegar residue as the main material，the preparation of reducing sugar from vinegar residue is studied through acidic hydrolysis and enzymatic hydrolysis respectively.Single factor tests and orthogonal experiment designmethods L9（3）4areappliedtoanalyzetheinfluenceofhydrolysisconditionontheyieldofreducingsugarofthevinegarresidue. Under optimal conditions reducing sugar is 33.89%，the vinegar sugar is 39.46%obtained by acidic hydrolysis.Then the content of determined by Van Soest method.Culture of Rhodotorula by hydrolysis of vinegar residue，and the Rhodotorula is directlycultured as the control.After the enzymatic hydrolysis，the carotenoid reached 19.94 mg/g.Carotenoid reached 17.61 mg/g after acidic hydrolysis.By analysis and data processing，the enzymatic hydrolysis is better than that of acidic hydrolysis and the direct culture of Rhodotorula in vinegar residue.

vinegar residue；Rhodotorula；hydrolysis；fermentation；reducing sugar

TQ920.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.030

1671-9646（2016）08b-0001-05

2016-06-28

郑洛昀（1989— ），女，在读硕士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

辛嘉英（1966— ），男，博士，教授，研究方向为生物催化。