厚壁毛竹快速高生长期竹秆ATP酶超微细胞化学定位

许婷婷，杨光耀，杨清培，于 芬

(江西农业大学 江西省竹子种质资源与利用重点实验室，南昌330045)



厚壁毛竹快速高生长期竹秆ATP酶超微细胞化学定位

许婷婷，杨光耀，杨清培，于 芬*

(江西农业大学 江西省竹子种质资源与利用重点实验室，南昌330045)

采用电镜细胞化学技术对厚壁毛竹(Phyllostachysedulis‘Pachyloen’)快速高生长期竹秆节间的伸长发育过程(包括：分生细胞期、伸长初期、快速伸长期和成熟期四个阶段)进行ATP酶超微细胞化学定位，以揭示竹秆节间快速伸长的细胞学基础。结果表明：分生细胞期，细胞质膜、核膜、细胞器膜系统上等均有很强的ATP酶活性。伸长初期，节间上部基本组织细胞质膜上ATP酶活性较强，且短细胞质膜上的ATP酶活性更强，节间基部各细胞均未观察到ATP酶活性。快速伸长期，节间基部基本组织ATP酶活性较节间上部高，细胞质膜、运输小泡膜、胞间隙及胞间连丝上均有ATP酶活性。成熟期，仅节间上部基本组织质膜上有较弱的ATP酶活性。ATP酶在节间伸长过程中主要参与新细胞壁物质的分泌和共质体运输，促进新细胞壁的形成，晶体和淀粉粒体外膜上ATP酶活性的存在表明其具有贮存物质的作用。节隔缺失节的节间基部未观察到ATP酶活性，节部韧皮结细胞ATP酶活性较高，节隔的缺失引起节部与节间与物质运输有关结构的变化，进而影响节间伸长生长。

厚壁毛竹；ATP酶；高生长；竹秆；节间伸长

厚壁毛竹(Phyllostachysedulis‘Pachyloen’)是目前发现在毛竹(Phyllostachysedulis)众多变异类型中一个同时兼具优良用材和笋用价值的品种，具有竹秆壁厚、基部近实心、笋味好、抗性强、生物量大、遗传稳定等优良性状，具有广泛的应用前景[1]。目前，在厚壁毛竹主要生物学特性、出笋成竹规律、生理生化特性如光合作用和蒸腾动态、抗寒性、竹材物理力学性能等方面进行了系统的研究[2-14]。

高生长是竹类植物生长发育的关键过程，与生物量密切相关。高生长期竹秆节间快速伸长，在短时间内达到最大高度。目前许多研究表明居间生长是禾本科植物高生长的关键因素，主要通过居间分生组织的生长引起节间伸长。有关竹类植物居间分生组织和居间生长的研究较少，以毛竹、刚竹、水竹等经济竹种研究较多。研究表明，在竹类植物高生长过程中居间分生组织的分化和分裂引起节间伸长；居间分生组织在笋尖与节部无明显的界限，随着竹笋的生长，居间分生组织区域逐渐缩至节间基部[15-18]。尽管有关竹子高生长规律的研究已积累了一定的成果[19-22]，也发现了一些与高生长有关的基因[20-25]，但高生长过程中节间快速伸长的机制尚未明确。因此，深入开展厚壁毛竹竹秆快速高生长的细胞学机制研究，可为提高竹产量、促进竹产业发展，有效提高竹子的生态效益和经济效益提供理论依据。

ATP是生物体内能量转换的重要物质，直接参与细胞内各种代谢反应。ATP酶在生物体内广泛分布，催化ATP水解，与物质的跨膜运输、信号转导、细胞内物质的合成与分解等代谢活动中能量的贮存和供应密切相关[26-27]，因此研究生长发育过程中ATP酶的时空动态变化具有十分重要的理论和实际意义。本试验拟通过对厚壁毛竹快速高生长期竹秆ATP酶的定位研究，进一步探讨竹秆节间快速伸长的细胞学基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料厚壁毛竹(Phyllostachysedulis‘Pachyloen’)于2015年4月10日采自江西农业大学竹类植物种质园。取不同发育阶段的竹笋，根据竹笋的实际高度和总节数，从基部开始计数，分别取第3节、第9节、第15节、顶部、第5节(节隔缺失节)各节间和节部，每一节间分别切取上部和基部。

1.2 实验方法

实验方法根据甘小洪等[28]稍有改动。所取材料于低温环境下迅速切成1 mm×1 mm×1 mm左右的小块投入50 mmol/L(pH 7.2)二甲胂酸钠缓冲液配制的4%多聚甲醛与2. 5%戊二醛的固定液中，4 ℃下初固定3 h；4 ℃下用50 mmol/L(pH 7.2)的二甲胂酸钠缓冲液清洗3次，每次0. 5 h；然后用50 mmol/L(pH 7.2)的Tris-Maleate缓冲液清洗2次，每次0. 5 h，4 ℃下进行。随后转移到酶孵育液中孵育2.5 h，酶孵育液的组成为50 mmol/L(pH 7.2)的Tris-Maleate缓冲液中含ATP钠盐2 mmol/L、Pb(NO3)23 mmol/L、MgSO45 mmol/L。孵育后，在4℃下先用50 mmol/L(pH 7.2)的Tris-Maleate缓冲液清洗2次，每次0.5 h；再用50 mmol/L(pH 7.2)的二甲胂酸钠缓冲液同样清洗2次，每次0.5 h；再在4 ℃下，放于50 mmol/L(pH 7.2)的二甲胂酸钠缓冲液配制的1%锇酸固定液中固定过夜。50 mmol/L(pH 7.2)的二甲胂酸钠缓冲液4 ℃下清洗2次，每次20 min；后用重蒸水清洗3次，每次0.5 h；将清洗好的材料经乙醇、丙酮系列脱水，Epon812树脂包埋，LKB-V型超薄切片机切片，切片不经染色，在日立7650透射电子显微镜下观察拍照。

2 实验结果

根据解剖结构特征，节间的伸长发育过程可分为分生细胞期、伸长初期、快速伸长期和成熟期四个阶段。

2.1 分生细胞期

基本组织细胞处于分生细胞状态，细胞核位于中央，染色质深，双层核膜明显；细胞器以线粒体和内质网为主，有淀粉粒分布(图版Ⅰ, A)。在质膜、液泡膜、线粒体外膜、内质网膜、核膜及液泡内的降解物上均有较强的ATP酶活性(图版Ⅰ, B、C)。

2.2 伸长初期

伸长初期，竹秆节间上部的基本组织细胞处于初生壁形成期，细胞内存在大量的淀粉粒(图版Ⅰ, D)。基本组织细胞的质膜上有大量ATP酶分布，且以短细胞质膜上的ATP酶活性较高，同时长细胞内的运输小泡膜、淀粉粒体外膜上以及晶体膜边缘也有少量的ATP酶活性物质沉积(图版Ⅰ, D、E)。纤维细胞质膜上的ATP酶沉积物零星分布(图版Ⅰ, F)。

与节间上部相比，竹秆节间基部的长、短细胞形态差异不显著，在基本组织细胞和纤维细胞的质膜、核膜、液泡膜上未发现明显的ATP酶活性(图版Ⅰ, G、H)。

竹秆节部基本组织细胞的质膜、核膜、运输小泡膜、胞间连丝及晶体外膜均有ATP酶活性(图版Ⅰ, I、J)。韧皮结细胞处于初生壁形成期，在韧皮结细胞质膜边缘有较强的ATP酶活性(图版Ⅰ, K)。筛管细胞质膜上ATP酶活性较强，液泡膜及液泡内ATP酶活性较弱。伴胞细胞内存在正在形成的蛋白质晶体，未观察到明显的ATP酶活性(图版Ⅰ, L)。

2.3 快速伸长期

快速伸长期，节间上部的基本组织细胞和纤维细胞的细胞壁明显增厚。短细胞较长细胞分化程度低，沿质膜边缘分布的运输小泡较多。在基本组织细胞质膜和运输小泡膜上均有ATP酶活性(图版Ⅱ, A、B)。韧皮纤维细胞质膜及运输小泡上ATP酶活性较低(图版Ⅱ, C)，筛管细胞和伴胞细胞的质膜上ATP酶活性较强(图版Ⅱ, D)。

节间基部，长细胞的质膜、运输小泡膜、胞间隙边缘上有ATP酶活性；短细胞以质膜上ATP酶沉积物较多，线粒体膜、运输小泡也有少量沉积(图版Ⅱ, E)。韧皮纤维细胞质膜上ATP酶活性较强(图版Ⅱ, F)。筛管细胞内含有大量的蛋白晶体-P蛋白(图版Ⅱ, G)，纹孔上ATP酶活性较强(图版Ⅱ, H)。伴胞细胞的质膜和液泡内的降解物上有少量ATP酶活性物质(图版Ⅱ, I)。

竹秆节部的基本组织细胞处于初生壁形成期，细胞边缘有大量运输小泡分布。在运输小泡膜和胞间连丝上有较强的ATP酶活性，质膜和液泡膜上ATP酶活性较弱(图版Ⅱ, J)。韧皮结细胞初生壁明显加厚，在质膜、核膜、运输小泡膜及液泡膜上ATP酶活性均较强(图版Ⅱ, K)。韧皮纤维质膜上ATP酶活性较弱(图版Ⅱ, L)。

2.4 成熟期

成熟期竹秆节间上部的基本组织长细胞次生壁加厚，细胞内容物多数降解。仅在基本组织细胞质膜上存在较弱的ATP酶活性(图版Ⅲ, A)。纤维细胞内未观察到ATP酶活性物质沉积(图版Ⅲ, B)。

竹秆基部的基本组织细胞和纤维细胞处于次生壁形成期。基本组织细胞核和细胞内其他物质均已边缘化分布，细胞间隙变大(图版Ⅲ, C)；纤维细胞内大部分物质已降解(图版Ⅲ, D)。2类细胞内均未有ATP酶活性物质沉积。

未在节部基本组织细胞内观察到明显的ATP酶活性(图版Ⅲ, E)。纤维细胞的细胞壁明显加厚，具线粒体的纤维细胞质膜上有ATP酶活性(图版Ⅲ, F)。韧皮结细胞内有少量运输小泡和大量正在发育的蛋白质晶体，细胞间存在大量胞间连丝，在降解物和小泡膜上有较弱的ATP酶活性(图版Ⅲ, G)。

2.5 节隔缺失节的ATP酶活性

2.5.1 节间基部 节隔缺失节的节间基部，长细胞的细胞核多边缘化分布，有淀粉粒体和晶体存在；短细胞内液泡自两端聚集，向中央靠拢(图版Ⅲ, H)。纤维细胞细胞核核膜开始降解，中央大液泡未形成。在薄壁细胞和纤维细胞内未观察到ATP酶活性(图版Ⅲ, H、I)；多数细胞的液泡内有团状黑色物质沉积。与短细胞相比，长细胞的液泡内存在更多的黑色物质(图版Ⅲ, I)。

2.5.2 节部 竹秆节部的长细胞液泡膜和质膜上ATP酶活性较弱；短细胞质膜上ATP酶活性较强(图版Ⅲ, J)。纤维细胞的质膜、液泡膜上均有较弱的ATP酶活性(图版Ⅲ, K)。多数韧皮结细胞细胞核双层核膜明显，出现核穿孔现象。在其质膜、核膜、液泡膜上均有很强的ATP酶活性(图版Ⅲ, L)。

3 分析与讨论

前人研究发现，毛竹节间基本组织和纤维生长发育过程中，在基本组织和纤维细胞初生壁形成期，质膜、运输小泡、细胞器膜系统上均有ATP酶活性[28-29]。一般认为ATP酶在质膜、胞间连丝、运输小泡等膜体系上沉积，主要的功能是参与物质的分泌和共质体运输过程；胞间隙和细胞壁上的ATP酶主要与物质的质外体运输有关；而在线粒体和叶绿体片层内积累的ATP酶则对物质的分解和合成起重要作用[30]。本研究结果表明，节间伸长初期，节间上部的ATP酶分布广泛，多分布于质膜和运输小泡膜上，与节间基部相比，ATP酶活性较强。表明在节间伸长初期，节间上部ATP酶主要参与新细胞壁物质的分泌和共质体运输，促进新细胞壁的形成，提高细胞壁的伸展性，进而影响细胞的伸长。在节间上部基本组织内晶体和淀粉粒体外膜上也有ATP酶活性，此时淀粉粒和晶体可能起到贮存物质，为细胞伸长提供物质和能量的作用。

快速伸长期节间各细胞质膜上均有较强的ATP酶活性，节间基部的ATP酶除了同节间上部一样在质膜和运输小泡膜上分布，在线粒体外膜、胞间连丝和胞间隙内均有ATP酶活性，与前人研究基本组织ATP酶沉积部位相同[28，31]，纤维细胞则主要在质膜上沉积。快速伸长期，节间ATP酶主要参与共质体运输，同时基部ATP酶与质外体以及物质的合成有关，与新细胞壁的形成、细胞伸长有密切关系。

熊文愈[15, 30]在研究毛竹节间生长过程中发现，存在由顶端分生组织直接衍生而来的居间分生组织，在节间伸长初期，整个节间以居间分生组织为主导，节间进行居间生长；随着节间伸长，节间上部细胞停止分裂，居间分生组织逐渐限于节间基部，最后亦成熟老化。董丽娜[32]在研究毛毛竹高生长过程中发现节间始终有一些由初生分生组织衍生而来的原始细胞，且在竹子节间伸长的过程中保持较长时间的分裂能力，短细胞即原始细胞；同时，节间分生组织区域随着节间的伸长而逐渐缩小，分裂能力也逐渐减弱。本研究表明在厚壁毛竹节间伸长过程中，节间未观察到明显的居间分生组织细胞，短细胞保持着较高的细胞活性；在快速伸长期节间基部也未观察到居间分生组织，基本组织和纤维细胞占节间主要部分，且节间伸长的主要因素是基本组织和纤维细胞的分裂和伸长导致的。

厚壁毛竹竹秆在生长过程中经常会出现节隔缺失现象，节隔缺失的节间基部细胞内未观察到ATP酶沉积物；节部ATP酶主要分布在基本组织的质膜、纤维细胞的质膜和液泡膜及韧皮结细胞质膜、核膜、液泡膜上，且活性均较强。相较于快速伸长期韧皮结细胞，ATP酶活性均较高。而快速伸长期韧皮结细胞间及与薄壁细胞相接处具有较多的胞间连丝，胞间连丝上ATP酶活性很高，细胞间进行密切的物质运输，为基本组织的生长提供物质和能量。由于竹秆节间的维管束具有严格的轴向方向，完全被基本组织细胞分开而相互游离，也没有分支的现象，使维管束在节间无法进行大量横向的物质交流，仅在节部，维管束弯曲、分枝形成复杂的结构，所以竹秆中物质的横向运转和环流主要发生在节部[30, 33]。韧皮部在节部形成特殊的“韧皮结”结构[34-36]，主要进行分流、短距离运输。节隔缺失的节部内，韧皮结细胞的ATP酶活性升高也证明了韧皮结在竹秆内物质横向交流运输中的重要作用。节部结构异常变化引起节间长度的异常，节隔的缺失引起节部与节间与物质运输有关结构的变化，从而影响节间伸长生长。

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MC.分生细胞；PC.薄壁细胞；LPC.长细胞；SPC.短细胞；F.纤维细胞；PG.韧皮结细胞；ST.筛管；CC.伴胞；N.细胞核；K.核膜；ER.内质网；M.线粒体；V.液泡；Nu.核仁；TV.运输小泡；IS.胞间隙；Pi.纹孔；Pla.胞间连丝；CW.细胞壁；PP.P蛋白；SG.淀粉粒；C.晶体；下同A～C.分生细胞期：A.分生细胞；B.细胞核具明显的双层核膜；C.各细胞器上的ATP酶沉积，液泡内也有少量沉积；D～L.伸长初期：D.节间上部基本组织质膜上ATP酶活性；E.节间上部的短细胞内未降解的细胞核，有晶体存在；F.节间上部纤维的质膜上ATP酶活性；G.节间基部的薄壁细胞内ATP酶活性，有淀粉粒；H.节间基部的纤维细胞，有两个明显的核仁；I.节部的短细胞ATP酶活性；J.薄壁细胞质膜上ATP酶活性，有晶体；K.韧皮结细胞ATP酶活性；L.筛管细胞和伴胞细胞ATP酶活性图版Ⅰ 分生细胞期和伸长初期ATP酶活性MC.Meristematic cell; PC.Parenchyma cell; LPC.Long parenchyma cell; SPC.Short parenchyma cell; F.Fiber; PG.Phloem ganglion; ST.Sieve tube; CC.Companion cell; N.Nucleus; K.Karyotheca; ER.Endoplasmic reticulum; M.Mitochondria; V.Vacuole; Nu.Nucleolus; TV.Transport vesicle; IS.Intercellular space; Pi.Pit; Pla.Plasmodesma; CW.Cell wall; PP.P-protein; SG.Starch grain; C.Crystal；The same as belowFig. A-C. The meristematic cell stage: Fig. A.Meristematic cells; Fig. B.Nucleus had clear double karyotheca; Fig. C.Different kinds of organelle membrane system had high ATPase activity, which a small amount of deposition within the vacuole; Fig. D-L. The initial elongation stage: Fig. D.The plasma membrane of the ground tissue had high ATPase activity in the upper part of internode; Fig. E.There were undegraded nucleus and crystals in the short parenchyma cells; Fig. F.The plasma membrane of fiber also had ATPase activity in the upper part of internode; Fig. G.The ATPase activity and starch grains in the ground tissue in the basic part of internode; Fig. H.The fiber cells had two distinct nucleolus in the basic part of internode; Fig. I.The ATPase activity in the short parenchyma cells of the node; Fig. J.The ATPase activity and crystals in ground tissue; Fig. K.The ATPase activity in the phloem ganglion; Fig. L.The ATPase activity in the sieve tube cells and companion cellsPlate Ⅰ The ATPase activity in the meristematic cell stage and initial elongation stage

A.节间上部长细胞ATP酶活性；B.节间上部短细胞ATP酶活性；C.节间上部纤维细胞ATP酶活性；D.节间上部筛管和伴胞细胞ATP酶活性；E.节间基部薄壁细胞ATP酶活性；F.节间基部纤维细胞ATP酶活性；G.筛板上分布大量P蛋白；H.纹孔上ATP酶活性；I.筛管细胞ATP酶活性；J.节部的薄壁细胞与韧皮结细胞间的胞间连丝上ATP酶活性；K.韧皮结细胞胞间连丝上ATP酶活性；L.节部的纤维细胞ATP酶活性图版Ⅱ 快速伸长期ATP酶活性Fig. A.The ATPase activity in the long parenchyma cells in the upper part of internode; Fig. B.The ATPase activity in the short parenchyma cells in the upper part of internode; Fig. C.The ATPase activity in the fiber cells in the upper part of internode; Fig. D.The ATPase activity in the sieve tube cells and companion cells; Fig. E.The ATPase activity in the ground tissue in the basic part of internode; Fig. F.The ATPase activity in the fiber cells in the basic part of internode; Fig. G.There were a large number of P-protein in the sieve elements; Fig. H.The ATPase activity in the pit; Fig. I.The ATPase activity in the sieve elements; Fig. J.The plasmodesma between parenchyma cells and phloem ganglions had ATPase activity; Fig. K.The plasmodesma between phloem ganglions had ATPase activity; Fig. L.The ATPase activity in the fiber cells in the nodePlate Ⅱ The ATPase activity in the rapid elongation stage

A～G.成熟期：A.节间上部的短细胞ATP酶活性；B.节间上部的纤维细胞ATP酶活性；C.节间基部的薄壁细胞ATP酶活性；D.基部的纤维细胞ATP酶活性；E.节部的薄壁细胞ATP酶活性，少量胞间连丝存在；F.纤维细胞的细胞壁明显加厚；G.韧皮结细胞ATP酶活性；H～L.节隔缺失节：H.薄壁细胞ATP酶活性；I.纤维细胞ATP酶活性；J.节部薄壁细胞ATP酶活性；K.纤维细胞ATP酶活性；L.正在发育的韧皮结细胞ATP酶活性，有核穿孔现象图版 Ⅲ 成熟期和节隔缺失节的ATP酶活性Fig A-G. The maturity stage: Fig. A.The ATPase activity in the short parenchyma cells in the upper part of internode; Fig. B.The ATPase activity in the fiber cells in the upper part of internode; Fig. C.The ATPase activity in the parenchyma cells in the basic part of internode; Fig. D.The ATPase activity in the fiber cells in the basic part of internode; Fig. E.The ATPase activity and little plasmodesma in the parenchyma cells in the node; Fig. F.The cell walls of fiber cells thickened significantly; Fig. G.The ATPase activity in the phloem ganglions; Fig. H-L. The internode which had no diaphragm: Fig. H.The ATPase activity in the parenchyma cells; Fig. I.The ATPase activity in the fiber cells; Fig. J.The ATPase activity in the parenchyma cells in the node; Fig. K.The ATPase activity in the fiber cells in the node; Fig. L.The ATPase activity in the developing phloem ganglions which had nuclear perforation phenomenonPlate Ⅲ The ATPase activity in the maturity stage and the internode which had no diaphragm

(编辑:潘新社)

Ultracytochemical Localization of ATPase during the Rapid Elongation Growth Stage inPhyllostachysedulis‘Pachyloen’ Culms

XU Tingting, YANG Guangyao, YANG Qingpei, YU Fen*

(Jiangxi Provincial Key Laboratory for Bamboo Germplasm Resources and Utilization, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

The ultracytochemical localization of ATPase during the rapid height growth stage inPhyllostachysedulis‘Pachyloen’ culms was studied with cytochemical technology. The development of internode elongation can be divided into four stages: meristematic stage, initial elongation stage, rapid elongation stage and maturity stage. The results showed that the plasma membrane, karyotheca, organelle membrane system all had high ATPase activity at the meristematic stage. During the initial elongation stage, the plasma membrane of the ground tissue had high ATPase activity in the upper part of the internode, while the short parenchyma cells had higher ATPase activity. There is no ATPase deposition in any cells of the basic part of internode. During the rapid elongation stage, ATPase activity of ground tissue in the basic part of internode was higher than that in the upper part, where the plasma membrane, transport vesicle, intercellular space and plasmodesma all had ATPase activity. Only the plasma membrane of ground tissue in the upper part of internode had low ATPase activity during the maturity stage. During the elongation growth of internode, ATPase was mainly related with synthesis and transport of new cell wall materials, while ATPase around the crystals and starch grains outer membrane played a role in storing materials. At the basic part of internode which had no diaphragm, ATPase activity was not observed, while phloem ganglion had high ATPase activity in the node. The changes of the structure related to mass transport between internode and node were caused by the loss of diaphragm, furthermore influenced internode elongation.

Phyllostachysedulis‘Pachyloen’; ATPase; growth in height; culm; the elongation growth of internode

1000-4025(2016)08-1566-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1566

2016-04-22;修改稿收到日期:2016-07-04

国家自然科学基金(31460177,31000289)

许婷婷(1991- )，女，硕士研究生，主要从事植物发育解剖学研究。E-mail: xutingting19910715@163.com

*通信作者:于 芬，副教授，硕士生导师，主要从事发育植物学研究。E-mail: yufen930@163.com

Q944.62

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