透射电镜三维重构技术在螺旋纳米材料手性判断中的应用

陈木子，朱 兴，唐明华，郭 军，冯善娥

(苏州大学分析测试中心，江苏苏州 215123)

螺旋碳纳米材料因其有较高的比表面积、较好的机械和热力学等性能在不对称催化、手性传感器和电磁波吸收等领域有重要的研究和实用价值[1 - 5]。螺旋结构纳米材料因旋转方向不同带来手性之分，对螺旋纳米材料的手性确认也引起了研究者的兴趣。目前螺旋纳米材料的形貌观测主要借助于扫描电镜和透射电镜，但单纯利用扫描电镜和透射电镜的二维图像作为螺旋材料手性判断的依据还不够准确完善。

近几年，透射电镜的三维重构技术在结构生物学及材料学中取得了快速发展，已广泛应用于研究蛋白质的结构及一些材料的内部结构的分析[6 - 11]。透射电镜三维重构技术起源于20世纪60年代，1968年Rosier和Klug[12]在Nature上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4噬菌体尾部三维结构的著名论文，透射电镜的三维重构技术引起了广泛关注。透射电镜三维重构技术的基本原理基于中央截面定理：任何实空间的三维物体，沿入射光线方向的二维投影的傅立叶变换，是该物体三维傅立叶变换后，在倒易空间中垂直于该入射光线方向的一个过中心点的二维截面。根据中心截面定理，收集物体在各个方向的二维投影照片后，经过傅立叶变换及反傅立叶变换就可以恢复该物体的三维结构[13,14]。

三维重构技术作为螺旋纳米材料手性确定的方法目前未见文献报道。本研究利用我中心配有三维重构附件的Tecnai G2F20透射电镜(TEM)，收集倾转不同角度后的纳米螺旋材料透射电镜图像，对每张投影图进行傅立叶变换，按照投影方向填充到三维傅里叶空间对应的切面，再进行反傅立叶变换，就可得到螺旋纳米材料实空间的三维结构模型从而分析和确认材料的手性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Tecnai-G2F20透射电子显微镜(美国，FEI公司)；S-4700扫描电子显微镜(日本，HITACHI公司)；E-1010真空镀膜仪(日本，HITACHI公司)。

实验所用L-型和D-型模板剂制备的两种单手螺旋的3-氨基苯酚-甲醛树脂及一种酚醛树脂进一步碳化得到单手螺旋碳质纳米管样品由苏州大学材料与化学化工学部提供。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 待测样品准备

取少量样品放入小烧杯中，加入适量的无水乙醇，放入超声震荡仪中超声8 min左右，用移液枪移取样品分别滴于200目的碳支持膜铜网上和硅片上，用红外灯烘干后，备用。

1.3 扫描电镜形貌表征

将制备好的硅片上的样品用导电双面胶粘在样品台上，放入喷金电镀仪里，设置工作电流为15 mA，喷金时间为60 s，进行真空喷镀。将喷镀好的样品放入扫描电镜室观察；扫描电镜工作电压为15 kV，工作电流为10 mA，选择合适的放大倍数后聚焦拍照。

1.4 透射电镜形貌表征

将制备好的载有样品的碳支持膜铜网放入透射电镜样品杆上，将样品杆插入镜筒，电镜合轴对中后使用。透射电镜工作电压为200 kV，工作电流为74 μA，点分辨率为0.24 nm。选择合适的放大倍数后聚焦拍照。

1.5 透射电镜三维重构实验

本文主要报道利用Tecnai-G2F20透射电镜结合三维重构样品杆，通过对超分子模板法制备的单手螺旋酚醛树脂和进一步碳化制备的单手螺旋碳样品进行系列角度倾转，获取透射电镜二维图片原始数据，再应用Inspect 3D及Amira软件进行后期数据处理与分析(包括密度分割、建立模型等)，从而确定螺旋树脂及螺旋碳纳米管的手性。

1.5.1实验步骤(1)将制备好的样品放入Tecnai-G2F20透射电镜中，找到位于铜网网格中间并且螺旋长轴方向与样品杆方向一致的样品。(2)检查调试透射电镜使电镜处于良好工作状态。在Xplore软件中设置合适参数，样品的最大倾转角范围为-70°～+70°。根据样品的情况确定样品的实际倾转角范围，以间隔角为1°或2°对样品进行倾转，用CCD相机(Gatan 832)记录不同倾转角度下得到样品的多张二维原始图片。(3)利用Inspect 3D软件对收集的原始图片筛选并进行匹配，主要是基于样品基本特征和交互相关性(Cross Correlation)对图片进行旋转和偏移校正，然后利用加权背投影(WBP)、代数迭代(ART)或同步迭代(SIRT)等方法进行三维重构。(4)利用Amira软件进行数据分析使三维重构的结果合成为可视化的立体模型[15]。

1.5.2实验注意事项要建立准确的三维重构模型，正确判断螺旋材料的手性，在数据的采集和处理过程中必须注意以下几个方面：(1)电镜合轴和三维重构参数校准。主要包括:电镜不同模式下精确合轴对中，CCD相机参数设置、放大倍率校准、样品漂移校准、光束倾斜校准、自动聚焦校准、自动调节聚焦高度校准及样品杆校准。(2)选择合适的铜网目数和样品的位置，增加样品的倾转角度范围，减小缺失锲的体积[6,15]，以减弱缺失锲的存在造成的模型误构问题。(3)在数据的采集中设置合理的滤波波长范围，利用Xplore系统有效滤波去除噪音、识别样品的特征位置、计算样品的漂移轨迹，从而达到有效进行漂移校正的目的。(4)样品杆倾转过程中，精确调节三维重构Xplore软件中auto focus的参数，设置合适的欠焦量，以确保样品整个倾转过程中获取清晰图片，同时加入合适尺寸的物镜光阑来提高图像衬度。

2 结果与讨论

2.1 L-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂样品的形貌和结构分析

L-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂样品的透射电镜形貌和扫描电镜形貌观察结果如图1所示。利用透射电镜形貌图片无法直观判断样品的手性，在扫描电镜图片上根据样品形貌衬度变化可初步推断样品为右手螺旋。但单一的扫描电镜二维图像也不能够完全准确的确认样品的手性。为了进一步准确判断样品的手性，对样品进行了三维重构实验并进行了分析。实验中采用Tecnai-G2F20透射电镜配置的三维重构软件Xplore采集透射电镜的原始图片数据，确认样品的可倾转角度范围为-55°到+60°，对样品进行每隔一度连续倾转后采集116张图片。图2(a～c)显示了用三维重构软件Xplore采集的样品倾转-55°、0°、+60°后的透射电镜的原始二维图片。应用Inspect 3D软件对116张图片进行二维图像匹配及三维重构，并用Amira软件进行后期模型建立，最终得到三维重构后的模型(图2d)。通过对三维重构模型不同角度及不同方向倾转后进行观察和分析，从而确认L-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂样品为右手螺旋结构。

2.2 D-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂样品的形貌和结构分析

D-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂与L-型模板制备树脂虽然是同类螺旋材料，由于使用的模板不同，所形成的手性应有所不同。为了确定D-型模板制备的树脂所形成的手性，同样对样品也进行了三维重构实验确定手性。

透射电镜形貌和扫描电镜的形貌图如图3所示，从扫描电镜形貌图片上初步判断样品为左手螺旋。对样品的三维重构数据采集步骤和L-型模板制备的样品相似。选取从-58°到+60°每隔一度连续倾转采集119张图片。图4(a～c)是样品用三维重构软件Xplore采集透射电镜的原始图片中分别倾转-58°、0°、+60°的图片。图4d为数据处理后的三维重构立体模型。从模型中进行不同角度的观察分析判断D-型模板制备的3-氨基苯酚-甲醛树脂样品为左手螺旋。这充分说明了利用透射电镜三维重构方法对螺旋纳米材料手性进行判断的可行性和准确性。

2.3 L-型单手螺旋碳质纳米管的结构分析

L-型单手螺旋碳质纳米管样品不仅管的外部存在螺旋结构，其内部也存在螺旋结构，内部螺旋手性判断的难度更大。根本无法从透射电镜和扫描电镜的形貌图片(图5)中判断出内部手性。

本文通过透射电镜的三维重构技术对L-型单手螺旋碳质纳米管内部螺旋的手性进行了判断。相似的方法，样品倾转角范围为-60°到+60°，采集121张图片。图6(a～c)是样品用三维重构软件Xplore采集透射电镜的原始图片中样品分别倾转-60°、0°、+60°的图片。应用Inspect 3D软件对121张图片进行二维图像匹配及三维重构，并用Amira软件进行后期数据处理分析，最终重构出样品的三维模型。

为了判断样品的外部和内部螺旋的手性，通过对三维重构模型(图6d)进行合适角度的旋转显示出外部螺旋结构为左手手性。但是单从三维模型的分析无法对样品的内部螺旋手性进行判断。本文对三维重构模型进行切片取图，共有443张切片图，图6e为第200张切片图。根据多张切片图空心处的黑白衬度及螺旋的走向判断样品内部螺旋手性为左手。因此透射电镜三维重构方法不但可以准确地判断螺旋材料的外部手性，用于螺旋材料内部手性的判断也具有实际的应用意义。

3 结论

通过扫描电镜和透射电镜对两种单手螺旋3-氨基苯酚-甲醛树脂及一种单手螺旋碳质纳米管样品形貌观察和分析不能直观准确的确认材料的手性。本文利用透射电镜三维重构技术，选择合适的采集和重构参数，进行三维模型的建立及分析，对两种单手螺旋3-氨基苯酚-甲醛树脂样品结合扫描电镜的形貌观察后进一步确认了材料的手性。对单手螺旋碳质纳米管，在通过扫描和透射电镜二维形貌观察都无法判断其内部手性的情况下，本文通过透射电镜三维重构技术，重构三维模型后进行切片取图，通过对切片图的分析确认其手性。透射电镜三维重构技术作为手性判断的方法具有准确可行性，这也为其它纳米螺旋材料特别是内部螺旋材料的手性判断提供了判断方法和依据，在推动螺旋材料的手性研究中具有重要的实际意义。