青海大通三种小檗的小檗碱含量动态变化

向前胜　王宁　赵越　邹林有　孙奎　王凯月

摘要：通过采用2010年版《中华人民共和国药典》中“三颗针”中的盐酸小檗碱含量测定方法，对青海省大通县3种小檗属（Berberis L.）植物不同时期、不同部位小檗碱的含量进行测定。结果显示，各部位中根部的含量最高；各季节中，10月份的含量最高；3个种内，直穗小檗（B. dasystachya Maxim.）的含量高于其他2个种。试验结果可为综合开发青海省小檗属植物资源、扩大小檗碱的药材来源和药用部位、合理利用野生药用植物提供科学依据。

关键词：小檗；小檗碱；含量；动态变化；大通县

中图分类号：Q949.746.8（444DT） 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2045-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.031

Abstract： Using the determination method of berberine content in Sankezhen according to “Pharmacopoeia of People's Republic of China”， the berberine content in different organs of three Berberis Species in Datong county of Qinghai province during different periods was tested. Result shows that the berberine content is the highest in root among different organs， and is the highest in October among different period. The berberine content in B. dasystachya Maxim. is higher than in the other two species. This research could provide scientific basis for comprehensive development and reasonable utilization of Berberis resources in Qinghai， as well as for the expansion of medicinal plants resources and medicinal parts.

Key words： Berberis L.； berberine； contents； dynamic changes； Datong county

小檗属（Berberis L.）为小檗科（Berberidaceae）中的大属之一，业内习称为“三颗针”[1]，又名铜针刺、刺黄连、小檗等；其种类繁多，分布范围广，喜生于高海拔山区的山坡、林缘、灌丛、沟边[2]。小檗属植物所含的小檗碱是一种重要的医药原料，应用领域较广，在体外对抑制结肠癌、肝癌[3，4]、白血病[5]、鼻咽癌等多种癌细胞以及抗病原微生物方面均有显著的作用[6，7]。青海省是小檗属植物的重要分布区，有13种及1个变种，主要分布在青海省的大通、门源、循化、祁连、互助、尖扎、囊谦县等地[8]。其中鲜黄小檗（B. diaphana Maxim.）、直穗小檗（B. dasystachya Maxim.）、西北小檗（B. vernae Schneid）在省內分布范围广，资源蕴藏量大，开发利用前景广阔。大通县地处青海省东部，海拔2 280～4 622 m，全县森林覆盖率达38.1%，居青海省之首，水资源总量6.9亿m3，是全省重要的水源涵养基地。其地处青藏高原，地形复杂多变，具有较强的代表性，因此试验以大通县为采样基地，通过比较3种小檗属植物在不同生长时期中不同部位的小檗碱含量差异变化，为青海省小檗资源的有效开发利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 野外样品采集 分别于2013年10月、2014年5月和2014年7月在青海省大通县宝库乡拉塄沟等地进行秋季、春节和夏季采样，经青海省农林科学院野生植物资源研究所鉴定为鲜黄小檗、直穗小檗和西北小檗。样品为经自然干燥的根、茎秆和枝梢。采样点情况见表1。

1.1.2 试剂 乙腈，色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司生产；甲醇，色谱纯，美国fisher公司生产；磷酸二氢钠，分析纯，成都科龙化学试剂厂生产；盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride）标准品（HPLC测得含量≥98%），批号110713-201402，中国药品生物制品检定所生产。

1.1.3 仪器 Waters ELSD 2424 高效液相色谱仪（美国Waters公司），Welchrom C18色谱柱（月旭材料科技上海有限公司），BS214S 电子天平（德国Sartorius公司），微量移液器（德国艾本德公司），pH计（上海大普仪器有限公司），KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 测试样品制备 将采集到的新鲜小檗属植物根部泥土处理干净，自然干燥，按单株分别将根部、茎秆、枝梢、叶、果实分开，将5株同种植物同部位材料分别称取10 g混合，经粉碎机处理，过65目筛，保存，待测。

1.2.2 盐酸小檗碱的含量测定方法 小檗碱的含量测定方法采用2010年版《中华人民共和国药典》的“三颗针”中盐酸小檗碱含量的测定方法[9]，每样品重复测定3次，取均值。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氢钠（24∶76）；流速1.0 mL/min，检测波长345 nm，柱温30 ℃。

1.2.4 对照品溶液的制备与标准曲线 精密称取盐酸小檗碱标准品，加甲醇分别制成10、20、30、40、50 μg/mL的母液，用带有0.45 μm过滤膜的微孔针头取滤液20 μL进样。精确吸取各浓度的标准样各20 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，标准品浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=4.99e+0.04X-1.08e+0.05，R=0.999 277。该方程表明，盐酸小檗碱在此条件下呈良好的线性关系。其标准品色谱图见图1，5次进样峰面积值与浓度的标准曲线见图2。

1.2.5 供试品溶液的制备 取供试品粉末（过65目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

1.2.6 样品测定 用带有0.45 μm过滤膜的微孔针头取供试样品续滤液20 μL进样，保留时间为16 min。

1.3 数据分析

采用 IBM SPSS Statistics 19统计分析软件及Microsoft Office Excel 2007 数据处理系统对不同时期、不同种、不同部位小檗属植物中小檗碱含量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 植株各部分小檗碱含量测定

取西北小檗根、茎秆、枝梢、叶、果实部分，按照供试品溶液制备法制备供试品溶液，每处理3次重复，经0.45 μm针筒过滤器过滤，精密吸取20 μL进样，每样品重复进样3次，将峰面积按外标法计算，被测样品中小檗碱的含量测定结果见表2。由表2可见，5个部位均含有小檗碱，其中根部、茎秆、枝梢部位小檗碱的含量远远高于叶片、果实部位。因此，后续试验选取有效部位为根部、茎秆和枝梢。

2.2 有效部位的含量测定

按照根部、茎秆、枝梢部位小檗碱的含量远远高于叶片、果实部位的结果进行不同时期、不同部位3种小檗属植物小檗碱含量的测定，结果见表3，高效液相色谱结果见图3。从表3和图3可见，不同时期产自青海省大通县的3种树龄相同的小檗属植物中不同部位的小檗碱含量都不相同，可见不同时期对3种小檗属植物体内各部位小檗碱的含量影响是明显的。其中10月份各部位小檗碱的含量除鲜黄小檗枝梢外，其他都高于7月份和5月份。尤其是根部含量最高，如鲜黄小檗的小檗碱含量为28.245 μg/mL，直穗小檗达到了49.682 μg/mL，西北小檗为29.015 μg/mL。都大大高于茎秆和枝梢部。总体来看，直穗小檗根部的小檗碱含量高于另2个种。

3 小结与讨论

3.1 不同时期小檗碱含量的差异

在植物的年生长周期内，5月份的植株正处于枝叶生长阶段，光合同化产物主要供给植物营养生长，次生代谢的底物浓度较低，影响其生物合成过程，因而次生代谢物含量较低。7月份，植株体内营养物质主要是供给茎部加粗，次生代谢合成途径占主要地位，次生代谢物合成较多。到了10月份，植株基本停止生长，体内生理活动减弱，呼吸代谢减慢，生长抑制剂等增多，由于内源和外源因素的调节，次生代谢物更多处于代谢不活泼的库中，没有发生转移，就在各器官中积累下来，从而使次生代谢产物含量较高[10-12]。不过由于青藏高原特殊的地理条件和自然环境，小檗碱并不是次生代谢的最终产物，它会经过进一步的代谢转化为药根碱[13]。

3.2 不同部位小檗堿含量的差异

试验里同种小檗属植物其不同部位小檗碱含量是不一样的，植物不同部位次生代谢物的差异性表现在两个方面，即不同部位次生代谢物种类的差异性和不同部位同种次生代谢产物含量的差异性；但同一部位又表现为次生代谢物的相似性。次生代谢物的形成和储藏位点都严格限制在植物的一定发育期、特殊的器官、组织和特化的细胞内[14-16]。虽然生物碱合成水平受基因控制，但环境的影响也使生物碱在植物体内产生不均匀分布[17]。因而在小檗属植物的根、茎秆、枝梢部小檗碱的含量分布出现了差异。

3.3 不同种小檗碱含量的差异

树龄、生长时期、立地条件相同的不同种植物，其次生代谢物含量在不同个体间的变化是不同的，主要取决于该物种的遗传基因。所以3种小檗属植物各自的遗传因素影响着体内小檗碱的含量分布。

根据试验结果，在青海省小檗属植物资源深度利用开发上，利用时期建议以春、夏季为主；鲜黄小檗的利用建议以根为主；直穗小檗的利用以根和主茎秆为主，可尝试培育一、二年生植株根、茎作为药材来源；西北小檗的利用则建议利用主茎秆和枝梢，可专门培育地上主茎秆和枝梢部位，通过平茬等方式来利用。

试验为综合开发利用青海省小檗属植物资源奠定了理论基础，为扩大小檗属植物的药材来源和药用部位提供了科学依据。特别是改变了传统上认为全部小檗属植物根部小檗碱含量高于其他部位的观念，这将改变西北小檗挖根式的利用方式，减轻原有的利用方式所带来的生态环境和资源破坏力度，有助于实现资源的可持续合理利用。

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