黑尾近红鲌精子活力研究

王贵英　李清　祝东梅　李佩　熊传喜　刘文伟　陈见　孙艳红

摘要：在水温23 ℃的条件下，对黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）精子在不同浓度氯化钠溶液、不同水体以及不同离体时间情况下的活力进行了研究。结果表明，①在0～1.2%的氯化钠溶液中，氯化钠浓度小于0.5%时，随着浓度的增加，黑尾近红鲌精子快速运动时间随之延长；在0.5%氯化钠溶液中，精子快速运动时间最长（52.00±3.46 s），与其他组别差异显著（P<0.05）；当浓度大于0.9%时，精子未激活。②精子在蒸馏水中的快速运动时间（36.33±1.15 s）显著（P<0.05）高于在自来水（32.00±1.00 s）和池塘水（27.67±1.52 s）中。③采用蒸馏水激活离体精子1～15 h，随着时间的延长，存活精子快速运动时间无显著差异（P>0.05），而精子成活率显著降低（P<0.05）。

关键词：黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）；精子活力；激活剂

中图分类号：S965.123 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2062-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.036

Abstract： The spermatozoa motility of Ancherythroculter nigrocauda in different concentrations of NaCl solution， different water bodies and different strorage time in vitro were investigated under the temperature of 23 ℃.The results showed as follows： ①In 0～1.2% NaCl solution， the rapid movement time of the sperm of A. nigrocauda tended to longer with the increase of NaCl concentration when it was less than 0.5%； the life span of the sperm of A. nigrocauda （52.00±3.46 s） was the longest at 0.5% NaCl solution， which had significant difference （P<0.05） with compared to other groups； When the NaCl concentration was higher than 0.9%， the initiation of the sperm of A. nigrocauda was inhibited.②The rapid movement time of the sperm of A. Nigrocauda in distilled water （36.33±1.15 s） was significantly （P<0.05） higher than that of tap water （32.00±1.00 s） and the pond water （27.67±1.52 s）.③Using distilled water to activate the sperm of A. Nigrocauda in vitro 1～15 h， the rapid movement time of the survival sperms had no significant difference （P>0.05） with the extension of time， while the survival rate of sperm significantly reduced （P<0.05）.

Key words： Ancherythroculter nigrocauda； sperm motility； activator

魚类精子是一类分化程度很高的细胞，在精巢中不活动，一旦与其生存的水环境接触，精子便立即被激活而开始运动。激活精子并影响精子活力的因素很多，如渗透压、无机离子、酸碱度、水温。对鱼类精子而言，渗透压的影响至关重要[1]，精子的部分能量就是消耗在渗透压的调节上。Morisawa等[2]用不同渗透压的氯化钠、氯化钾和甘露醇溶液进行精子激活试验，发现一些淡水硬骨鱼类，如鲫（Carassius auratus）、褐三齿雅罗鱼（Tribolodon hakonensis）的精子在高渗透压溶液中不活动，呈抑制状态，若加入1滴去离子水，精子立刻被激活而运动，而用低渗透压溶液去稀释精子，同样能诱发精子从抑制到激活状态。王祖昆等[3]研究发现精子处于渗透压偏高的溶液（大于270 mmol/L）中时，精子基本不活动，即高渗溶液抑制精子，低渗溶液激活精子。当溶液渗透压超过500 mmol/L时，精子的激活将受到影响；当溶液渗透压低于200 mmol/L时，精子的抑制与激活反应将逐步消失，淡水中激活后的精子将一直运动至死。罗明坤等[4]发现萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）精子在2.5%～3.2%的盐度范围内，萨罗罗非鱼精子活力较强，其中以3.0%的盐度时精子活力最高，激活率达90%。徐敏等[5]研究发现盐度为4时，方正银鲫[Carassius auratus gibelio（Bloch）]和大鳞鲃（Barbus capito）精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命最长；盐度为5时，松浦镜鲤（Songpu mirror carp）精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命最长；盐度达到8以上时，3种鱼的精子激活将受到抑制；盐度大于10时，方正银鲫和大鳞鲃精子死亡；盐度大于11时，松浦镜鲤精子死亡。精子活力是指精子群体运动状态与寿命长短，是反映精子质量的重要指标。精子活力评价是研究精子生理特性、精子受精、精子保存的基础。鱼类精子在良种选育、杂交育种、种质保护及种质改良等方面得到了广泛应用。

黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）俗名高肩、黑尾鲌，是鲌亚科鱼类中生长较快、味道鲜美的优良品种，深受广大养殖者和消费者的青睐。许多学者先后开展了黑尾近红鲌肌肉成分、生物学、人工繁养技术等方面的研究，如谭德清等[6]评价了黑尾近红鲌肌肉营养成分；薛正楷等[7-9]研究了黑尾近红鲌个体繁殖力、自然条件下的年龄与生长、比例性状、体长与体重的关系；李清[10]研究了黑尾近红鲌耗氧率与窒息点；王贵英等[11]、曹义虎等[12]研究了人工养殖条件下的黑尾近红鲌生长情况；丁立云等[13]初步研究了黑尾近红鲌幼鱼对蛋白质营养需求；李伟东等[14]研究了黑尾近红鲌饲料的适宜脂肪水平；白晓慧等[15]研究了不同年龄的黑尾近红鲌消化酶活性。目前，关于黑尾近红鲌精子活力研究尚未见报道，为加速其育种进程和产业化发展，精子生物学特性研究显得尤为重要，本试验研究不同浓度氯化钠溶液以及不同水体对黑尾近红鲌精子活力的影响，旨在为其科学研究和生产实践提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

黑尾近红鲌取自武汉先锋水产科技有限公司繁养基地，个体重0.6 kg左右，年龄为2冬龄，体质健壮，体表光滑无伤。

1.2 激活剂的配制和采集

激活剂采用0～1.2%的氯化钠溶液共13个浓度梯度，曝气自来水取自于繁养基地，池塘水来自于繁养基地的小型水库。

1.3 精子的采集与保存

采用DOM、LRH-A2、HCG等激素配伍对黑尾近红鲌进行催情后，将雄性黑尾近红鲌捕起，用干毛巾擦干体表和泄殖孔，轻压腹部取其精液，分别收集在洁净干燥的试管中。要求精液呈乳白色，无血、无尿液、无粪便污染；精子采集以后，应避免紫外线照射，盛有精液的试管置于放有冰块的保温瓶内备用。同时，试验样品保持在试验过程中不被风干。

1.4 精子活力观察

根据精子群体在激活液中的运动状况，不同的研究者将其分为不同的阶段。通过对精子运动状况的观察来直接反映其活力情况，精子活力等级划分参照吴景贵[16]的方法，将精子运动分为快速运动、中速运动、慢速运动、死亡，精子快速运动时间是从精液与试验溶液混合后70%的精子细胞转化为中速运动的时间，视野中有95%的精子停止运动的时间为其寿命时间。

用吸管吸1滴试验溶液于载玻片上，然后用解剖针挑取少许新鲜精液置入载玻片的液滴中，立即在10×40倍显微镜下观察精子被激活后的运动状况，并统计所经历的时间，每尾鱼鲜精连续观察3次，取其平均值[17]。解剖针每次蘸取后要用擦拭纸擦干净，以免对下组试验造成污染。精子活力观察分为3个内容：①不同浓度氯化钠溶液对黑尾近红鲌精子快速运动时间的影响，采用杨彩根等[18]、罗相忠等[19]的方法配制0～1.2% 13个浓度梯度的氯化钠溶液，对精子进行激活；②池塘水、自来水、蒸馏水对黑尾近红鲌精子快速运动时间的影响；③采用蒸馏水激活，观察离体精子1～15 h的活力。

1.5 数据分析

试验数据采用Statistica 6.0软件进行分析，组间采用Duncans多重比较，进行显著性水平分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度氯化钠溶液对黑尾近红鲌精子活力的影响

不同浓度氯化钠溶液中，黑尾近红鲌精子活力不同。由表1可见，在水温23 ℃时，精子适宜的氯化钠浓度为0.5%～0.6%。当氯化钠浓度为0.5%时，精子的快速运动时间达到最大值，为（52.00±3.46） s；氯化钠浓度大于0.5%时，精子的快速运动时间随浓度的上升而呈下降趋势；氯化钠浓度大于0.9%时，精子不能激活。通过对各组进行单因素的显著性检验时，发现0.5%组与其他组均存在显著性差异（P<0.05）。

2.2 池塘水、自来水、蒸馏水对黑尾近红鲌精子活力的影响

由表2可见，水温23 ℃时，黑尾近红鲌精子在不同水体中的快速运動时间不同，在池塘水、自来水和蒸馏水中的快速运动时间分别是（27.67±1.52） s、（32.00±1.00） s、（36.33±1.15） s；黑尾近红鲌精子在池塘水、自来水和蒸馏水中的快速运动时间存在显著性差异（P<0.05）。黑尾近红鲌精子在蒸馏水中激活效果最好。

2.3 不同离体时间对黑尾近红鲌精子活力的影响

由表3可见，采用蒸馏水激活，参照杨广等[20]的方法对不同离体时间的黑尾近红鲌精子进行观察，黑尾近红鲌精子离体15 h内，随着时间的延长，存活精子的快速运动时间（28.67～31.67 s）无显著变化（P>0.05），而精子成活率（15.67%～95.67%）显著降低（P<0.05）。

3 小结与讨论

观察比较黑尾近红鲌精子在池塘水、自来水、蒸馏水中的活力，以在蒸馏水中的运动效果最佳，快速运动时间为（36.33±1.15） s，这可能与不同水体的离子浓度、pH有关，或与不同水体的复杂成分引起。在实际生产中，精卵受精的稀释液建议采用蒸馏水。

黑尾近红鲌精子在不同浓度氯化钠溶液中的活力不同，在0～0.5%的范围内，其快速运动时间随浓度的增加而延长，以0.5%的浓度为最佳。氯化钠浓度大于0.5%时，随着浓度的增加，精子快速运动时间逐渐缩短；浓度大于0.9%时，黑尾近红鲌精子不运动。本研究结果与杨彩根等[18]对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）精子、魏开金等[21]对鲥鱼（Macrura reevesi）精子、周定刚等[22]对黄鳝（Monopterus albus）精子、徐敏等[5]对松浦镜鲤精子等研究结果是一致的；但与罗相忠等[19]对大口鲇（Silurus meridionlis）精子、罗明坤等[4]对萨罗罗非鱼精子、陈春娜等[23]对达氏鲟精子等研究结果不同。造成这些差异的原因，主要与不同鱼类精液的生理特性不同有关。

采用蒸馏水作为激活剂观察不同离体时间的精子活力，发现随着时间的延长，存活的精子数越来越少；但只要精子是存活的，其快速运动时间在各组之间无显著性差异（P>0.05）。这可能与精子在精液中的分布情况有关，精子从精巢排出后，精子的生存环境发生了改变，处于外围的精子易受外界条件的变化而影响存活；也可能与激活剂自身的激活机制有关，以至于用同一种激活剂在不同的时间条件下激活时会造成运动时间的一致性。

精子在精液和精浆中是没有活性的，只有当外界条件给予激活时才表现出一定的活性。精子的运动主要靠尾部鞭毛的摆动来进行，能量由顶体来提供。精子鞭毛大多为9+2结构，其外周的每对双联管中的亚管A含有动力蛋白，动力蛋白臂具有ATP酶活性，起着与横纹肌球蛋白横桥类似的机能作用。外界通过对cAMp-ATP-Mg2+系统的影响来实现对精子活力的控制。渗透压是影响精子活力的主要因素。Morisawa等[2]发现淡水硬骨鱼的精子可以被低于精浆渗透压的溶液激活，而海水硬骨鱼的精子可以被高于渗透压的溶液激活。盐类对精子活力具有调节作用，但是不同的盐类其调节的具体机制不同。有的无机盐表现出激活，有的却表现出抑制。本研究中NaCl（特别是Na+）对黑尾近红鲌精子在一定浓度范围内表现出了明显的激活倾向。NaCl在0～0.5%的浓度范围内，表现为逐渐激活；而浓度大于0.5%时，表现出抑制，在0.9%以上时黑尾近红鲌精子就完全不动了。因此，黑尾近红鲌人工受精时，可选择浓度为0.5%的NaCl溶液激活。

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