植物生长调节素对西南凤尾蕨组织培养的影响

王一诺　韦莹　李翠　李林轩　肖冬　王晓峰　韦坤华

摘要：以西南凤尾蕨（Pteris wallichiana）的成熟孢子为外植体，以MS、1/2MS为基本培养基，研究了植物生长调节素对西南凤尾蕨离体组织培养的影响。结果表明，不同细胞分裂素和生长激素配比对西南凤尾蕨的组织培养影响不同，最适诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；最适增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L，最高增殖倍数为7.05倍；最适生根壮苗培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率达到90%以上。

关键词：西南凤尾蕨（Pteris wallichiana）；植物生长调节素；组织培养

中图分类号：S682.35 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2117-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.052

Abstract：In this research， the spore of Pteris wallichianais was used as the explants and the MS，1/2MS were used as the basic culture medium to evaluate the effects of hormone combination on callus formation and plantlet regeneration of Pteri swallichiana. The results showed that the effects of cytokinin and anxinratio on tissue culture of Pteris wallichiana were significantly different，the best initial medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L.The combination of 6-BA and NAA processed an improvement effect for the micropropagation，and the best multiplication medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L，the highest proliferation times was 7.05. And the best rooting medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L， the rooting ratio was above 90%.

Key words：plant growth regulators； Pteris wallichiana； tissue culture

西南凤尾蕨（Pteris wallichiana），为凤尾蕨科凤尾蕨属大型陆生植物，生长于海拔800～2 000 m的林下沟谷或林缘，分布于中国西南及台湾、广东、广西等地[1]。其味苦、涩、性凉，具有清热止痢、定惊、止血的功能，主治痢疾、小儿惊风、外伤出血等症[2]。西南凤尾蕨叶形优美、叶色青翠碧绿，具有较高的园林观赏价值和药用价值。药用蕨类植物含有生物碱、黄酮类、酚类等多种活性物质，对多种疾病具有明显的治疗作用[3]。

随着观赏植物的发展和对蕨类药用植物的利用，人们对蕨类植物的需求量日益增大。由于繁育技术不过关，野外采挖对野生蕨类植物资源造成严重的破坏，人类活动的干扰加之植物本身的原因使蕨类资源受到威胁[4]。在传统的繁殖方法上，蕨类主要是依靠孢子繁殖和分株繁殖，而孢子繁殖在自然环境中的成苗率很低，分株繁殖则需要时间长并且得到的有效苗数量少，不能在短期内满足大量种苗的需求[5]。因此采用生物组织培养技术，可以有效在短时间内提高西南凤尾蕨的繁殖速度和质量。为了更好地开发西南凤尾蕨中药资源和观赏价值，本研究通过在培养基中添加不同的植物生长调节素，对西南凤尾蕨优良植株组织培养技术进行探讨和研究，为西南凤尾蕨的组培快繁提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试西南凤尾蕨样品采自广西壮族自治区药用植物园科研基地内野生健壮无病虫害的植株，选取其成熟孢子为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 取西南凤尾蕨带有成熟孢子的叶片，先用流水清洗叶片表面尘土污垢，然后用洗洁精溶液擦拭，并置于烧杯中进行流水冲洗15～20 min，再移至超净工作台上，用75%乙醇灭菌15～20 s，无菌水冲洗1 遍，用0.1% HgCl2浸泡8～14 min进行消毒，无菌水浸泡清洗3～4 次，每次约5 min，清洗时用玻棒不断搅拌，利于彻底洗出汞。然后将材料移置于灭菌的器皿内，用无菌滤纸吸干叶片表面水分后，用消毒好的解剖刀将孢子接种到培养基中。

1.2.2 培养基的选择 孢子诱导、继代增殖培养基以MS为基本培养基、添加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L，同时设不同的激素配比，孢子诱导培养基的激素配比分别设置为：6-BA 0.5 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0）mg/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.5、1.0、1.5）mg/L；继代增殖培养基设不同激素配比的配方为：6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1.0 g/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0） mg/L+AC 1.0 g/L；生根培养基以MS、1/2MS为基本培养基，并在每升加入蔗糖30 g、琼脂4 g，设不同激素配比4种，分别为：MS+NAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L、1/2MS+NAA 0.3 mg/L、1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L。以上培養基的pH均为5.8。

1.2.3 培养条件 设置其培养条件为温度（25±3） ℃，光照度20～30 μmol/（m2·s），光照时间12 h/d，进行孢子离体诱导、继代增殖与生根培养。

2 结果与分析

2.1 消毒条件的筛选

以0.1% HgCl2为消毒剂，设计1组消毒时间试验，分别设置5、8、11、14和17 min 5个时间梯度，将外植体接种于培养基20 d后统计污染率和成活率。结果（表1）表明，样品经0.1% HgCl2溶液消毒时间11 min时，消毒的效果最好，成功率达到80%。处理时间大于11 min时污染率降低，但死亡率明显的上升，当消毒时间为17 min时死亡率高达70%。而处理时间小于11 min时死亡率下降，但污染率较高，不利于外植体的诱导萌芽。

2.2 孢子离体诱导试验

以MS为基本培养基，采用不同的激素配比对孢子进行离体诱导，试验结果见表2。结果表明，当6-BA浓度不变时，添加不同浓度NAA对西南凤尾蕨的孢子诱导产生影响，当NAA浓度在0.1～2.0 mg/L时，随着浓度的升高，有利于孢子的诱导，形成的芽苗质地紧密，数量较多。6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L组合时孢子的诱导率最高，试验重复多次均得到相同的结果。

2.3 不同外源激素对西南凤尾蕨苗继代增殖的影响

将西南凤尾蕨的无菌芽接入含有不同激素配比的继代增殖培养基上，每天观察接入芽的微小变化，10 d后逐渐萌发出新芽，继而芽数慢慢增多，30 d后进行统计和观察芽苗增殖的情况。结果（表3）表明，在6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L的继代培养基上，对西南凤尾蕨的叶丛增殖有明显的促进作用，在NAA 0.1～1.0 mg/L浓度范围内，随着NAA的浓度增大，增殖系数不断增大，但当NAA增加到1.5 mg/L时增殖系数反而有所下降。在B8号（6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L）培养基中，苗的叶片浓绿，生长情况良好，该培养基中增殖倍数最大，且植株健壮，芽苗的质量较好。

2.4 不同外源激素对西南凤尾蕨苗生根的影响

将诱导出的继代苗单切接入不同激素组合的西南凤尾蕨生根培养基中，培养30 d后进行观察并统计生根率。结果（表4）表明，西南凤尾蕨试管苗在添加不同浓度生长激素的MS、1/2MS培养基上均能生根，苗的颜色浓绿，有少数的苗根部出现微黄，观察发现4种生根培养基诱导生根的情况，根粗大小依次为C4、C3、C2、C1，在生根培养基C4中生根效果最好，植株粗壮呈墨绿色，平均根数16.3，平均根长3.07 cm，平均的苗高8.1 cm，生根率均达到90%以上。而以1/2MS为基本培养基的生根培养基无论在生根率、根粗和苗高都优于MS为基本培养基的生根培养基。

2.5 再生苗的移栽

将西南凤尾蕨的试管苗经过壮苗生根培养后，挑选生长旺盛、健康根系发达的试管苗移入温室内放置，松开盖子并保持瓶内水分充足。3 d后取出试管苗洗净根部培养基，移栽于栽培的基质中，每天喷洒少量的水，基质以排水良好，不易发霉为宜。同时适度的遮阴，保持一定的湿度。移栽15 d左右，叶片开始慢慢的舒展，2个月后成活率达到90%。

3 小结与讨论

在培养基中添加不同生长调节素如细胞分裂素和生长素，细胞分裂素常与生长素相配合，用以调节细胞分裂、细胞伸长、细胞分化和器官形成，是植物快速生长所必需的因素，是诱导植物产出芽、生根的关键因素[6，7]。不同植物或同一植物在不同的培养阶段组织培养体系所需要的生长调节素浓度和种类的组合配比是不相同的[8]。

本研究采用孢子进行离体诱导试验，发现孢子在6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L配比的诱导培养基中，获得了较为理想的协调作用效果，出现绿芽点进而形成叶丛团。研究表明，多种植物生长调节素之间的协同作用要比单独一种激素的使用效果更好[9]。本研究结果也表明，在西南凤尾蕨的芽苗增殖和生根的培养中，6-BA、NAA的配合使用更利于西南凤尾蕨的生长。此外，还受到光照度、活性炭、温度的影响。适当的调整光照度，不仅有利于植物的生根，还能对株高和增殖率产生促进作用。活性炭能清除培养基中植物组织在代谢过程中产生的对培养物有不良或毒副作用的物质，提高培养物体内可溶性蛋白和总糖的含量，以利于植物的生长[10]。在试验中发现，西南凤尾蕨在培养一段时间后，底部会出现褐化的情况。相对而言，在培养基中添加适量的活性炭能减少西南凤尾蕨试管苗的褐化现象。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].第二卷.上海：上海科学技术出版社，1995.

[2] 刘 爽.蕨类植物的开发利用研究进展[J].民营科技，2012（6）：47.

[3] 韩 敬，赵 莉.蕨类植物繁殖研究进展[J].安徽农业科学，2005，33（7）：1261-1263.

[4] 张开梅，石 雷，李 东，等.西南凤尾蕨发育过程及其孢子的无菌繁殖[J].园艺学报，2008，35（1）：94-98.

[5] 曾道光，李春华.凤尾蕨组培快繁技术研究[J].云南农业科技，2009（4）：16-17.

[6] 周维燕.植物细胞工程原理与技术[M].北京：中国农业大学出版社，2001.

[7] 钱子刚.药用植物组织培养[M].北京：中国中医药出版社，2007.

[8] 李林轩，林 伟，李 翠，等.半支莲组织培养技术研究[J].广东农业科学，2014（2）：38-40.

[9] 苏 钛，黄宁珍，付传明，等.匙羹藤组织培养条件优化研究[J].广西植物，2009（1）：87-91.

[10] 张 明，夏鸿西，朱利泉，等.鐵皮石斛组织培养研究进展[J].中国中药杂志，2000，25（6）：323-326.