畜牧业中4种常用有益菌浓度与吸光度的关系

2016-10-20 15:20王改玲宋云杰高竞铎
江苏农业科学 2016年7期
关键词:活菌数有益菌回归方程

王改玲 宋云杰 高竞铎

摘要:为探索一种简单、准确、实用的活菌计数方法,通过分光光度计和平板计数法测定地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌4种菌的菌液吸光度和菌液浓度,并建立两者的线性相关关系。将4种菌接种于营养肉汤培养基中,培养18 h,每1 h取样1次,每个样品设3个平行。采用分光光度计(λ=600 nm)测定菌液吸光度(D值),同时采用10倍系列稀释法测定平皿菌落个数(CFU)。建立地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌指数期CFU(y)与D值(x)的回归方程,分别为y=31.89x+0.561、y=17.71x-0.507、y=18.09x-0.708、y=15.12x-0.270。4种菌稳定期的菌液浓度分别约为54×108、29×108、30×108、25×108 CFU/mL。

关键词:分光光度计法;有益菌;活菌数;吸光度;回归方程

中图分类号: S816.73 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2016)07-0274-02

微生态制剂(microecologics)即动物食入后在消化道中生长、发育或繁殖的活体微生物饲料添加剂,具有增强免疫、提高营养的作用,主要包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、肠球菌、酵母菌等。微生态制剂具有防治消化道疾病、降低幼畜死亡率、提高饲料利用率、促进动物生长等作用,并具有无毒副作用、无残留、不产生抗性等优点,可作为安全性较好的饲料添加剂[1]。由于微生物个体较小,测量微生物生长应测量群体的增加量而不是细胞个体大小[2],从而导致其添加量不易控制。在生产应用中,因添加量过多导致动物患病、添加量不足导致效果不佳的现象时有发生,影响了养殖业使用微生态制剂的积极性。

本研究探索一种实用方法来判断微生物各阶段的数量,建立快速、简单、准确的细菌浓度测定方法,以便养殖场合理使用微生态制剂。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)购自国家菌种保藏中心,编号为29212。屎肠球菌(Enterococcus faecium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)均由河南省发酵工程实验教学示范中心分离,由南京市金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的培养 将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的单个菌落接种于装有5 mL营养肉汤的试管中,置于HWS-250型培养箱,于37 ℃下恒温培养18 h。

1.2.2 菌液D值的测定 分别将2 mL地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌培养所得种子液接种于 98 mL 营养肉汤中,摇匀后置于37 ℃下恒温振荡培养18 h。采用721G型可见分光光度计(λ=600 nm)测定4种菌液的D值,每1 h测定1次。

1.2.3 平皿菌落个数的测定 采用平板计数法测定平皿菌落个数。无菌操作取1 mL菌液加入装有9 mL已灭菌生理盐水的试管中,混匀后再取1 mL加入下一支试管中,重复以上操作将菌液稀释至10-1、10-2、……、10-9不同的稀释度。采用移液枪取200 μL菌液涂布于平板,每个稀释度涂布3个平板作为平行对照。置于37 ℃下恒温静置培养12 h后,采用菌落计数法进行计数。

1.2.4 菌液浓度与吸光度关系的建立 以菌落浓度为纵坐标、D值为横坐标建立4种菌生长曲线,并采用Excel 2007软件计算生成趋势线,获得回归方程及其相关系数[3]。

2 结果与分析

2.1 生长周期的测定

测定地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌18 h内的D值,利用Excel 2007软件绘制细菌的生长趋势曲线(图1)。

由测得的D值并结合图1可得出以营养肉汤为培养基,于pH值7.2、温度37 ℃条件下生长时,细菌延滞期(lag phase)、指数期(exponential phase)、稳定期(slationary phase)、衰亡期(decline phase)时间与D值的关系(表1)。

2.2 4种菌指数期浓度与D值的关系

采用Excel 2007软件处理分析地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌液指数期D值与活菌数的线性回归方程及相关性系数,绘制4种菌的活菌数与D值之间的线性关系。由图2可知,4种菌的CFU与相应D值线性相关。

由于细菌达到稳定期时活菌数基本保持不变,对稳定期的菌液进行抽检。经实际测定,稳定期的活菌数基本符合指数期活菌数的计算公式(表2)。

3 结论与讨论

3.1 有益菌添加量的重要性

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种有益菌在生长过程中消耗畜禽胃肠道内的氧气,造成厌氧环境,促进有益菌群的繁殖;同时增加肠道内酸度,抑制病原菌(沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌)生长,减少机体内条件性致病菌的危害。另外,4种有益菌在生长过程中产生多种营养物质和消化酶,为机体提供营养物质,改善动物消化道微生态平衡,修复强化肠道黏膜;降低血液和肠道中氨的浓度,并减少向体外生态环境的排泄量,改善饲养环境及生态环境[4-8]。

目前,很多规模化养殖场已开始自己生产微生态制剂,但微生态制剂中每种菌的添加量均有一定标准,添加量过多或过少对动物具有极大影响。粪肠球菌添加量过多可能导致动物肠道内菌群的失衡,甚至导致动物死亡;添加量过少则使产品的功能无法达到预期效果,从而影响了微生态制剂在畜牧业生产中的推广。

3.2 菌液中活菌数与吸光度的线性关系

微生物在发酵过程中,指数期菌液的吸光度与细菌数表现为极显著的线性相关关系[9],在本试验也可得到验证。由图2可知,在以营养肉汤为培养基的菌液中,地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌4种菌的活菌数(y)与吸光度(x)的线性回归方程分别为y=31.89x+0.561(r=0.989)、y=17.71x-0.507(r=0.987)、y=18.09x-0.708(r=0.993)、y=15.12x-0.270(r=0.995)。4种菌的相关系数r>0.874,表明以营养肉汤为培养基的4种菌液中,活菌数与吸光度的相关性极显著,两者间呈极显著的线性相关关系。可见,4种菌处于指数期的菌液活菌数可用相应的吸光度来评定。

3.3 分光光度计法的应用

生产过程中使用的有益菌多数处于稳定期和指数期。在特定培养条件下,处于稳定期的活菌数是相对恒定的(表2)。在实际生产过程中测量菌液浓度时,可通过分光光度计测量菌液的D值,再利用线性关系(表2)计算菌液中的活菌数,从而准确、便捷地判断菌液中的活菌数。

3.4 本方法与传统方法的比较

在微生态制剂中,益生菌的添加量是至关重要的因素,因此菌液中活菌数的测定显得尤为重要。目前常用的细菌计数法主要有显微镜直接计数法、平板计数法、细菌计数仪法等。

显微镜直接计数操作繁琐,且包含死菌数,对试验人员的技术操作要求高,在生产中应用较少。平板计数法和细菌计数仪法对操作人员的技术水平要求较高,检测工作量大、周期长、成本高,在生产中不便于推广。

本试验采用的分光光度计法以平板计数法为基础,借助分光光度计测定菌液的D值,达到及时掌握菌液中活菌数(实时定量)的目的。本方法采用的721G型分光光度计造价低、操作简单、准确快捷,易于在畜牧业生产中推广使用。今后养殖场制作微生态制剂时,可通过D值确定菌液中的活菌数。

参考文献:

[1]李 杰,盖士其,刘志国. 微生态制剂及其发展前景[J]. 山东畜牧兽医,2006(5):50-53.

[2]杨柳燕,肖 琳. 环境微生物技术[M]. 北京:科学出版社,2003:36-37.

[3]高允彦. 正交及回归试验设计方法[M]. 北京:冶金工作出版社,1991.

[4]刘光辉. anpu01屎肠球菌对肉鸡生产性能和免疫效果的影响[J]. 山东畜牧兽医,2013,34(4):14.

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[6]Verschuere L,Rombaut G,Sorgeloos P,et al. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2000,64(4):655-671.

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