地塞米松促进猪繁殖与呼吸综合征病毒致病性

王永娟　朱善元　刘博

摘要：为检测地塞米松对猪感染PRRSV后免疫力及致病性的影响，将6头健康猪平分为2组，分别注射地塞米松和生理盐水，连续注射3 d。检测注射前、注射后1周的PRRSV抗体阳性率及病毒量，观察并记录体温、呼吸、饮食、眼结膜、粪便等临床情况。结果显示，猪的PRRSV抗体阳性率为100%，但注射后的抗体值高于注射前；病毒蛋白半定量结果显示病毒感染量显著增加；注射地塞米松组的猪表现出一定临床症状，而对照组未发生变化。结果表明，地塞米松会增加PRRSV的发病风险，为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定了基础，为兽医临床中合理使用糖皮质激素类药物提出新的要求。

关键词：糖皮质类激素；地塞米松；猪繁殖与呼吸综合征病毒；致病性

中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0293-02

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）广泛存在于各养殖场，可引发免疫逃避，呈带毒但不发病、条件性致病状态[1]。发病时表现为PRRSV与其他病原同时存在，呈继发或并发感染[2]。病猪的临床症状变化较大，通常出现体温升高、食欲下降、气喘咳嗽、肢体末端瘀血、共济失调、运动减少、精神状态不佳等症状，死亡率达50%以上，母猪流产率达30%以上，给养猪业造成了巨大损失[3-4]。PRRSV抗体产生较早，但初始1周内产生的抗体不具有中和作用，仅能作为一种指示性抗体用于病毒感染的早期检测；中和抗体产生比较缓慢，一般于病毒感染后1～2个月出现[5]。

地塞米松为代表性糖皮质激素类药物，对抗炎、免疫抑制、抗内毒素、抗休克、影响代谢具有显著作用[6-10]，在兽医临床中被广泛应用于治疗母畜代谢病，或与抗生素联合用于治疗感染性疾病。有报道表明，地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，促进PRRSV感染或致病。拟将地塞米松注射于健康猪，通过临床症状、标志性抗体、病毒量等方面摸索开展PRRSV试验感染的条件，为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。地塞米松（国药准字H41020036）由江苏农牧科技职业学院动物实习医院提供。RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、琼脂糖、病毒RNA提取试剂盒均购自美国Promega公司。

1.2 试验动物

30日龄健康仔猪购自江苏省如皋市某规模化养殖猪场。

1.3 猪群PRRSV抗体检测

在如皋市某猪场选取10头未发病的30日龄仔猪，无菌采血并分离血清，按照猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒使用说明书检测抗体水平，分别读取D450 nm，每个血清样品做2个重复。按照该试剂盒的判断标准，被检血清平均吸光值（S）/标准阴性血清平均吸光值（N）值≥2.40判为阳性，<2.40判为阴性。

1.4 适应性饲养与药物注射

根据S/N值判断仔猪的PRRSV抗体阳性率，选择其中读值较低的6头猪，分别称其质量，用耳号钳标记，适应性饲养于经氯仿消毒的畜舍。3 d后，将1～3号猪作为地塞米松注射组，按0.067 mg/kg的剂量进行肌肉注射，每天09：00、15：00各1次，连续注射3 d；将4～6号猪作为生理盐水注射组（阴性对照）。

1.5 临床症状观察

自注射地塞米松1 d起每天观察并记录食欲、精神状态、皮肤、呼吸、眼结膜、体温、粪便等临床症状，连续观察7 d。

1.6 试验猪PRRSV抗体检测

于停止注射1周后无菌采集猪血并分离血清，按照“1.3”节的抗体检测方法分别测定6头猪的D450 nm。

1.7 病毒半定量测定

根据GenBank已公布的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）、低致病性PRRSV（LP-PRRSV）的Nsp2基因序列，分别设计能扩增出400 bp或（和）264 bp的特异性上、下游引物，同时设计能扩增出600 bp β-actin的上、下游引物[12]。于注射1周后采集6头猪的唾液，按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取其总RNA，进行Nsp2基因的半定量RT-PCR检测，电泳后采用ND-1000型分光光度计进行灰度扫描，根据各组Nsp2基因变化判断病毒量。

2 结果与分析

2.1 猪群PRRSV抗体

按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书，测得10头未发病30日龄仔猪的PRRSV抗体D450 nm值（表1），根据该试剂盒的判断标准，判断10头被检猪的阳性率为100%，但是均未发病。

2.2 临床发病记录

按照D450 nm值由低到高的顺序选择6头被检猪进行分组试验，自注射地塞米松1 d起观察每头猪的临床症状。结果显示，生理盐水注射组（对照组）未出现明显临床症状，地塞米松注射组（试验组）的猪出现食欲下降、精神萎靡、皮肤瘀血、眼结膜潮红、腹泻症状。体温记录见图1，呼吸数记录（n=3）见图2，试验组的体温与呼吸数于注射地塞米松3 d起开始升高。

2.3 试验猪PRRSV抗体

于停止注射1周后测定猪的PRRSV抗体水平，D450 nm吸光值见表2。根据该试剂盒的判断标准，判断试验猪的阳性率与注射前一致，均为100%，但注射组血清的吸光值明显高于对照组血清。

2.4 病毒基因半定量测定

唾液样品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量检测结果见图3。6头猪均为LP-PRRSV病毒感染，而无HP-PRRSV病毒感染，试验组猪的病毒基因表达量比对照组提高3倍左右。

3 结论与讨论

PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬细胞（PAM）、肺血管内巨噬细胞（PM）内复制[13]，可在数小时至数天内破坏大量巨噬细胞，造成肺、淋巴结的损伤，使其对异物的非特异性吞噬清除功能大幅降低，易继发其他细菌或病毒感染[2]。已有研究表明，其他病原的协同感染往往可刺激PRRSV受体表达，从而使猪更易感染，这是PRRSV常与其他疾病同时存在的根本原因。自然状态下的PRRSV复制不易成功，为在实验室开展PRRS的攻毒保护试验，有必要摸索PRRSV的感染条件。地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，理论上可模拟其他病原促进PRRSV感染或致病。本研究选取感染PRRSV但未发病的猪为试验动物，人为注射地塞米松，结果显示地塞米松注射组的猪可在短时间内出现典型的PRRS症状，且抗体水平及病毒量均明显上升，而对照组未出现异常症状。结果表明，地塞米松可作为诱导剂增加猪感染PRRSV的风险并引起发病，可为今后建立PRRSV相关研究的试验动物模型奠定基础。

动物模型的建立一般应选择SPF动物，在隔离条件下进行试验。鉴于PRRSV带毒猪多、PRRSV抗体阴性猪场较少、SPF猪价格昂贵且运输不便等试验条件的限制，本试验选取带毒未发病仔猪，确保其他条件完全一致的情况下设立试验组与对照组，从临床症状、标志性抗体、病毒量方面判断地塞米松对PRRSV感染的影响，结果与预期一致，表明此方案具有可行性。

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