ICA—HPLC检测枸杞中赭曲霉毒素A提取方法的比较

刘海波　刘建利　贾沙

摘要：对免疫亲和柱-高效液相色谱法（ICA-HPLC）测定枸杞中赭曲霉毒素A（OTA）的提取方法进行研究。对4种提取液[0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4），0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10），甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1），2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）]提取下枸杞干果中OTA含量的回收率进行对比和差异性分析，对最佳方法做准确度和精密度试验，并用此方法检测宁夏市场枸杞OTA污染情况。结果显示，0.1 mol/L 正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）为最佳提取液，回收率为615%～77.19%，变异系数为2.22%～2.83%；以0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（5 ∶ 50）为提取液、ICA-HPLC法测定枸杞干果中OTA方法稳定、可靠；宁夏市场枸杞OTA检测结果显示不存在污染。

关键词：宁夏枸杞；赭曲霉毒素A；免疫亲和柱；高效液相色谱法

中图分类号： S567.1+90.1；R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0347-03

赭曲霉毒素A（OTA）是一类真菌毒素，主要由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和纯绿青霉（Penicillium viridicatum）产生的有毒代谢产物，对人及多种动物具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性，国际癌症研究机构IARC将其确定为2B类致癌物[1-4]。OTA污染范围较广，可污染粮食谷物、蔬果、干果、调味剂、啤酒、葡萄酒及中草药材等，严重影响人们的农业生产和食品安全[5]。

宁夏拘杞已有600多年的栽培历史，全区枸杞种植面积2.97万hm2，枸杞产品种类主要有枸杞干果、枸杞鲜果、枸杞鲜汁、枸杞粉、枸杞酒等[6]。由于枸杞具有多糖、含水率高、表皮有蜡质层等特性，使得枸杞鲜果制干时间较长，致使其易发生霉变。研究表明，一般情况下，采摘后的枸杞鲜果不经任何处理，3 d后霉变可高达50%～80%，严重影响枸杞干果的产量和质量[7-8]。目前，关于 OTA 纯化和测定方法的研究已经较为深入，但现有的提取方法很多，不同样品提取方法不尽相同，目前枸杞干果中OTA的研究未见报道，因此建立一种枸杞干果中OTA的提取方法具有重要意义。

本研究采用有机溶剂和碳酸氢钠等溶液为提取液提取枸杞干果中的OTA，从回收率、精密度、准确度等角度进行分析，找出一种简便高效的提取枸杞干果中OTA的方法，为宁夏枸杞安全生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

固相萃取装置（美国Varian）；CY-200电动粉碎机（台州市新恩精密量仪器有限公司）；赭曲霉毒素免疫亲和柱 IC CF-04 （北京泰乐祺科技有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200Series，美国 Agilent）；荧光检测器（Agilent Technologies 1200Series，美国 Agilent）；反相C18柱（pH值2～12，美国 Agilent）；Empower Software色谱数据处理系统（美国 Agilent）；微量移液枪（德国Eppendorf）。

1.2 试剂

OTA 标准品（纯度>99 %，Fermentek公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；其他试剂均为化学纯。

OTA 标准储备液的配制：1 mg OTA 标准品用甲醇完全溶解，定容至50 mL（浓度20 μg/mL，-20 ℃避光保存）。

OTA 标准工作液的配制：取2.5 mL OTA 标准储备液，用甲醇定容至50 mL（浓度1 μg/mL，4 ℃避光保存）。

样品：宁夏枸杞干果购自银川市同心路枸杞批发市场。

1.3 方法

样品准备（粉碎、称量、加标）→提取→免疫亲和柱净化→高效液相色谱仪检测。

1.3.1 提取 用粉碎机将干燥后的枸杞干果粉碎，取粉碎后的枸杞样品25 g，分别加入100 mL 0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4）[9-10]、0.1 mol/L正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）[11-12]、甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1）[13，15]、2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）[16-19]等4种提取液，高速搅拌3min，15 000 r/min离心10 min，上清液用1.2 μm滤膜过滤，取15 mL滤液用001 mol/L PBS稀释定容至100 mL，即为OTA提取液。

1.3.2 净化 免疫亲和柱净化方法参照孙林超等的方法[14-15]，并适当修改：（1）ICA柱活化。冰箱中取出免疫亲和柱使之恢复到室温，流尽保护液，使2～3 mL空气通过柱体。（2）上样。取20 mL OTA提取液过柱，流速控制在20～30滴/min。（3）淋洗。先用5 mL PBS（pH值7.2～7.4）淋洗，再用5 mL超纯水淋洗，弃去洗脱液，使2～3 mL空气通过柱体。（4）洗脱。用6 mL甲醇分3次洗脱（每次加入2 mL甲醇后孵育5 min再进行洗脱）。合并洗脱液用氮气吹干，用1 mL色谱流动相溶解，0.22 μm有机系滤膜过滤至样液瓶中，供HPLC检测。

1.3.3 HPLC-FD检测方法 色谱条件：参考AOAC2001方法[19-20]。反相C18柱（Eclipse XDB-C18分析柱，5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相为乙腈 ∶ 双重水 ∶ 冰乙酸=99 ∶ 99 ∶ 2，pH值=3.2；流速1.0 mL/min；荧光检测条件为激发波长330 nm，发射波长460 nm；进样量20 μL。

1.3.4 加标回收率计算方法

回收率=（加标样品测定值-空白样品测定值）/理论加标浓度×100%。

1.3.5 OTA含量计算公式

X=A×C×VAm×m

式中：X为宁夏枸杞子中OTA含量，ng/g；A为样液OTA峰面积；Am为标准液OTA峰面积；C为标准液OTA的浓度，ng/mL；V为处理后的最终样液体积，mL；m为最终样液相当的试样质量，g。

2 结果与分析

2.1 线性范围和检测限

取OTA标准工作液，以流动相为溶剂，分别配制浓度为2、3、5、10、20、60、100 ng/mL的OTA标准液，按高效液相色谱法条件进行检测，每个标准浓度分别检测5次，取平均值。以峰面积对OTA质量浓度C（ng/mL）进行回归分析，线性方程为y=1.311 4x+0.286 3，相关系数r2=0.999 0，结果表明OTA在2.0～100.0 ng/mL 范围内线性关系良好（图1）。OTA标品的保留时间为7.023 min（图2）。以3倍信噪比确定最低检出限为0.27 ng/mL。

2.2 不同提取液结果比较

称取25 g枸杞样品，加入OTA标准工作液（1 μg/mL）50 μL，分别采用4种提取液提取，采用ICA-HPLC检测，重复3次，结果见表1，以正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）为提取液回收率最高，达77.19%，变异系数最低，达2.25%，比以正磷酸 ∶ 甲醇 ∶ 水（1 ∶ 10 ∶ 4）、甲醇 ∶ 水（4 ∶ 1）、2% NaHCO3 ∶ 15% NaCl（1 ∶ 1）为提取液回收率分别高043、2793、3607百分点；结果表明正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）为最佳提取液；不同测定方法之间存在显著差异（P>0.05），说明提取方法影响回收率的测定。因此，后续试验中提取液均采用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）。

2.3 精密度试验

制备加标浓度为2 ng/g的加标样品，用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）提取，采用ICA-HPLC法检测，重复3次，平均回收率为77.19%，标准差为1.74 ng/g，变异系数为2.25%（表2），说明该方法精密度高，稳定性和重复性满足要求。

2.4 准确度试验

制备加标浓度为1、2、5 ng/g 的加标样品，用正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）提取，采用ICA-HPLC检测，重复3次，回收率为61.5%～77.19%，变异系数为2.22%～2.83%（表3），说明该方法回收率高，准确度能满足试验要求。

2.5 宁夏枸杞中OTA含量测定

随机抽取10份不同品种的市售宁夏枸杞进行检测，结果均未测得OTA存在，图4为市售样品“宁夏枸杞”的检测色谱图示。

3 结论与讨论

提取是OTA测定的重要步骤之一，不仅要依据OTA的理化性质选择不同的提取试剂，同时还要考虑样品性质。OTA溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水[3]，因此本试验选择甲醇、稀碳酸氢钠溶液等作为提取溶剂。本试验4种提取方法中得到的OTA回收率略低，原因可能与枸杞性质和免疫亲和柱净化有关。首先枸杞的基质非常复杂，OTA可以与基质中的大分子如糖类、纤维素、蛋白质等结合，从而导致提取过程中OTA损失较大；其次净化是OTA进行HPLC检测的重要前提，对于少量OTA的基质净化，免疫亲和萃取净化法是目前较好的方法[14]。免疫亲和柱具有高度特异性的优点，使用时不需要活化，但是上样液中有机溶剂含量要严格控制，甲醇体积分数不得超过20%，否则将影响OTA抗原抗体的结合反应[16]。另外，在甲醇提取过程中，一些与赭曲霉毒素结构相似的有机小分子诸如黄酮、色素、芳香物质等也被提取出来，这些物质可能会与抗原OTA竞争抗体上的结合位点，从而影响免疫亲和柱净化的回收效率，因此在保证较高净化纯度的同时回收率可能就不太理想，从加标样的色谱图中就可以反映出这一点。

本研究中对宁夏市场枸杞样品进行检测，均未检出OTA，可能是因为果农在鲜枸杞制干过程中采用含NaOH、乙醇、Na2CO3、对羟基苯甲酸乙酯及其钠盐、对羟基苯甲酸丙酯钠、过氧化氢和二氧化氯等成分的促干剂、脱蜡剂、防霉剂等，抑制了包括产OTA真菌在内的果栖霉菌的生长[7-8]；或商品加工包装过程中枸杞经过严格分拣，去除霉变的枸杞。

正磷酸 ∶ 甲醇（1 ∶ 10）溶液作为提取液采用ICA-HPLC检测枸杞干果中OTA的效果最好，并且研究方法稳定、可靠。对宁夏市场枸杞进行OTA检测，均未检测到OTA污染。

参考文献：

[1]高 翔，李 梅，张立实. 赭曲霉毒素A的毒性研究进展[J]. 国外医学：卫生学分册，2005，32（1）：51-55.

[2]丁建英，韩剑众. 赭曲霉毒素A的研究进展[J]. 食品研究与开发，2006，27（3）：112-115.

[3]刘建利，林 勤，王甜甜，等. 一种测定酿酒葡萄中赭曲霉毒素A的新方法[J]. 食品与发酵工业，2013，39（9）：175-179.

[4]Abarca M L，Accensi F，Bragulat M R，et al. Aspergillus carbonarius as the main source of ochratoxin a contamination in dried vine fruits from the Spanish market[J]. Journal of Food Protection，2003，66（3）：504-506.

[5]杨 蕾. 中药中赭曲霉毒素A的检测方法研究[D]. 北京：北京协和医学院，中国医学科学院，清华大学医学部，2010：6-9.

[6]陈玮琳. 枸杞果汁饮料加工及质量控制[D]. 银川：宁夏大学，2013：3-4.

[7]杜 静. 枸杞表皮蜡质及制干技术研究[D]. 兰州：兰州理工大学，2010：5-8.

[8]吴古飞. 枸杞干燥过程中防霉剂的开发与应用研究[D]. 兰州：兰州理工大学，2011：6-8.

[9]Mller T E，Nyberg M. Ochratoxin a in raisins and currants：basic extraction procedure used in two small marketing surveys of the occurrence and control of the heterogeneity of the toxins in samples[J]. Food Additives and Contaminants，2003，20（11）：1072-1076.

[10]Macdonald S，Wilson P，Barnes K，et al. Ochratoxin a in dried vine fruit：method development and survey[J]. Food Additives and Contaminants，1999，16（6）：253-260.

[11]吕相征，谢 妮，李业鹏，等. 用高效液相色谱法测定粮食样品中的赭曲霉毒素 A[J]. 中国医科大学学报，2002，31（4）：285-286.

[12]Serra R，Mendonca C，Abrunhosa L，et al. Determination of ochratoxin A in wine grapes：comparison of extraction procedures and method validation[J]. Analytica Chimica Acta，2004，513（1）：41-47.

[13]褚庆华，郭德华，王 敏，等. 谷物和酒类中赭曲霉毒素 A 的测定[J]. 中国国境卫生检疫杂志，2006，29（2）：109-117.

[14]Medina A，Mateo R，López-Ocaa L，et al. Study of Spanish grape mycobiota and ochratoxin A production by isolates of Aspergillus tubingensis and other members of Aspergillus section Nigri[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（8）：4696-4702.

[15]Galvis-Sánchez A C，Barros A S，Delgadillo I. Method for analysis dried vine fruits contaminated with ochratoxin A[J]. Analytica Chimica Acta，2008，617（1/2）：59-63.

[16]孙林超. 免疫亲和柱-高效液相色谱在白酒赭曲霉毒素A检测中的应用[J]. 酿酒科技，2009（3）：113-115.

[17]樊 祥，褚庆华，周 瑶，等. 液-液萃取结合免疫亲和柱层析净化-高效液相色谱测定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J]. 理化检验：化学分册，2008，44（8）：736-739.

[18]Timperio A M，Magro P，Chilosi G，et al. Assay of ochratoxin A in grape by high-pressure liquid chromatography coupled on line with an ESI-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2006，832（1）：127-133.

[19]Aresta A，Vatinno R，Palmisano F，et al. Determination of ochratoxin a in wine at sub ng/mL levels by solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A，2006，1115（1/2）：196-201.

[20]Visconti A，Pascale M，Centonze G. Determination of ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity column cleanup and liquid chromatographic analysis with fluorometric detection：collaborative study[J]. Journal of AOAC International，2001，84（6）：1818-1827.