白酒酒糟中抗氧化乳酸菌的筛选及培养基优化

钟正丹　何义国　赵兴秀

摘要：采用稀释涂布法结合革兰氏染色、纸层析法从四川泸州老窖浓香型白酒酒糟中分离乳酸菌，通过测定抗脂质过氧化率、超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率系统评价筛选的12株乳酸菌的抗氧化能力，旨在筛选出高抗氧化活性的乳酸菌，为天然抗氧化剂的开发及乳酸菌在功能性食品中的应用提供理论依据，并对其中1株抗氧化活性较高的4#菌株进行培养基优化。结果表明：共得到12株乳酸菌，其中4#菌株在上述3种评价体系中均表现出较强的抗氧化能力。对菌株4#进行培养基优化，其结果为牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值6，装液量为60 mL，且优化后4#菌株抗氧化能力提高了43.73百分点，这将为抗氧化菌株的进一步应用以及抗氧化产品的开发提供一定的理论依据。

关键词：酒糟；乳酸菌；抗氧化；培养基优化

中图分类号： TS261.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0533-04

乳酸菌广泛存在于泡菜、食醋、白酒、乳制品等发酵食品中，可改善食品风味，为发酵食品提供丰富的营养成分，提高食品附加值。有大量研究表明，乳酸菌具有调节肠道菌群、降低胆固醇、抑菌、抗癌、抗衰老、抗氧化等多种生理功能[1]。消费者对食品安全和食品生理功能日益关注，而乳酸菌具有天然无毒、保健益生等特性[2]，是一种天然抗氧化剂，这使其抗氧化能力研究成为食品工业的重点与热点[3]。

在食品科学领域，抗氧化乳酸菌可防止食品中油脂酸败，清除自由基从而阻止自由基连锁反应。研究表明，机体内自由基与机体衰老、癌症、心血管等疾病[4-5]也密切相关，开发抗氧化产品对抗衰老、预防疾病有着重要意义。目前，已有研究者针对抗氧化乳酸菌的筛选、体内外试验、作用机制[6-7]、有效成分等方面进行了相应研究。如张书文通过体外试验筛选抗氧化乳酸菌进行抗氧化效果研究[8]；刘天祎等从泡菜汁、鹅肠等原料中筛得2株抗氧化活性较高的干酪乳杆菌[9]。但对于抗氧化乳酸的研究仍处于初级阶段，应用范围还有待扩展。目前，抗氧化乳酸菌主要用于酸奶、抗氧化剂等方面，而在保健食品、酒类及饮料、化妆品等行业仍须不断地开发及创新。

本研究从四川泸州老窖浓香型白酒酒糟中分离抗氧化乳酸菌，以抗脂质过氧化率、超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率评价菌株抗氧化能力，得到抗氧化能力较强的乳酸菌，并可适应白酒生产过程中复杂的环境，这将对于抗氧化酒品及其乙醇饮料开发创新有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型白酒酒糟由四川泸州老窖股份有限公司提供。

吐温-80、氯化钠、葡萄糖、琼脂粉、正丁醇、焦性没食子酸、三羟甲基氨基甲烷等均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）。

1.2 试验仪器

55i+Ds-5M-UI正置生物显微镜（日本SONY公司）；UV2400紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；UP400S手提式超声波细胞粉碎机（宁波新生物科技有限公司）；FL-2可调式封闭电炉（北京市永光明医疗器械有限公司）。

1.3 培养基

MRS固体培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，琼脂18.0 g，用蒸馏水补足至1 L，pH值6.5。

初始培养基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，柠檬酸氢二钠2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸锰0.28 g/L，硫酸镁0.58 g/L，吐温-80 1 mL/L，装液量50 mL（250 mL三角瓶），pH值6.5。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分离纯化 称取5 g酒糟于50 mL离心管中，加入50 mL 0.8%生理盐水（加有玻璃珠），涡旋振荡，静置10 min，取1 mL上清液加入100 mL MRS液体培养基中，37 ℃ 静置培养24 h。取1 mL培养液进行10倍梯度稀释至10-7浓度，取0.1 mL不同浓度稀释液进行涂布，37 ℃静置培养24 h，挑取乳白色、圆形、较小、表面光滑、边缘整齐、中央隆起的菌落进行划线分离纯化，并观察其菌落形态。挑取培养时间为12 h的单菌落进行革兰氏染色，观察其显微镜下个体形态。将纯化后菌株接种于MRS斜面，于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 过氧化氢试验 挑取1环已纯化菌株于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。于0.5 min内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性[10]。

1.4.3 乳酸菌定性试验 采用纸层析法[11]。

1.4.4 抗氧化乳酸菌的筛选

1.4.4.1 样品前处理 无菌体发酵液（CFE）：挑取1环纯化菌株接种于MRS液体培养基中活化，以2%接种量接入MRS液体培养基中，37 ℃静置培养24 h后，4 000 r/min离心 20 min，收集菌体沉淀，取上清液进行无菌体细胞发酵液抗氧化能力的测定。

菌体细胞提取物（IC）：使用磷酸缓冲液（pH值7.0）洗涤菌体沉淀2次后，用无菌水调整为2×109个/mL的菌悬液，然后进行冰浴超声波破碎（功率400 W、工作时间5 s、间隔时间5 s、破碎时间30 min），破碎液于8 000 r/min离心20 min，取上清液进行菌体细胞提取物抗氧化能力的测定。

1.4.4.2 抗脂质过氧化率测定[12] 在试管中依次添加 0.5 mL PBS、1 mL亚油酸、1 mL FeSO4、0.54 mL样品。37 ℃水浴1.5 h，再添加0.2 mL三氯乙酸、2 mL硫代巴比妥酸，沸水浴30 min后迅速冷却，4 000 r/min离心20 min后过滤，收集上清液，测定D532 nm。以无菌水代替样品反应为空白组。抗脂质清除率的计算公式如下：

抗脂质过氧化率=（1-D532 nm/D532 nm（空白））×100%。

1.4.4.3 超氧阴离子自由基清除率测定 采用邻苯三酚法[13]。

1.4.4.4 DPPH自由基清除率的测定[14] 在试管中依次添加4 mL DPPH、2 mL样品、1 mL 50%乙醇，在暗处反应 60 min，离心20 min，取上清液，测定D517 nm。其计算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-D517 nm/D517 nm（空白））×100%。

1.4.5 抗氧化乳酸菌的培养条件优化 挑取1环抗氧化较强的菌株9#，接种于初始培养基中，37 ℃静置培养24 h备用。以DPPH自由基清除率为评价指标，分别研究不同碳源种类（葡萄糖、蔗糖、淀粉）、氮源种类（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）、碳源添加量（15、20、25、30 g/L）、氮源添加量（20、25、30、35 g/L）、pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）、装液量（40、50、60、70 mL）对DPPH自由基清除率的影响，从而得到最优培养基组合。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化

从浓香型白酒酒糟中共分离出12株乳酸菌，分别编号为1～12#，通过观察其菌落形态、个体形态，12株过氧化氢试验结果均为阴性，故初步鉴定为乳酸菌。其菌落形态、个体形态以4#为例，如图1所示。

2.2 乳酸菌定性试验

将12株菌株分别接种至MRS液体培养基中，于37 ℃、 150 r/min 培养24 h，离心取上清液进行纸层析，计算各菌株Rf值，其结果见表1。由表1可知，乳酸的Rf值为0.53，各菌株Rf值均为0.53左右，故12株菌株可确定为乳酸菌。

2.3 抗氧化乳酸菌的筛选

2.3.1 抗脂质过氧化率测定 12株菌分别接种于MRS液体培养基中于，37 ℃ 150 r/min培养24 h，经样品处理后得到无菌体发酵液和菌体细胞提取物，分别测定抗脂质过氧化清除率，其结果如表2所示。

由表2可知，不同乳酸菌的发酵液和菌体细胞提取物的抗脂质过氧化率差异很大。其中，发酵液的抗脂质过氧化清除率较高的有1#、2#、3#、4#、9#，分别为10.07%、13.09%、11.12%、10.23%、10.07%。菌体细胞提取物的抗脂质过氧化清除率较高的有1#、4#、9#、11#，分别为44.28%、47.71%、47.33%、41.60%。无菌体发酵液和菌体细胞提取物的抗脂质过氧化清除率均较高的为1#、4#、9#。

2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力的比较 12株菌分别接种于MRS液体培养基中，于37 ℃、150 r/min培养24 h，经样品处理后，得到无菌体发酵液和菌体细胞提取物，通过邻苯三酚法分别对各菌株的超氧阴离子自由基清除能力进行研究，结果如表3所示。

由表3可知，无菌体发酵液的超氧阴离子清除率较高的有2#、3#、4#、9#，分别为32.47%、35.12%、43.76%、35.01%。菌体细胞提取物的超氧阴离子清除率较高的有 4#、5#、9#，分别为37.56%、40.88%、42.29%。无菌体发酵液和菌体细胞提取物的超氧阴离子清除率均较高的为4#、9#。

2.3.3 DPPH自由基清除率的比较 12株菌分别接种于MRS液体培养基中，于37 ℃、150 r/min培养24 h，经样品处理后，得到无菌体发酵液和菌体细胞提取物，分别对各菌株的 DPPH 自由基清除能力进行研究，结果如表4所示。

由表4可知，无菌体发酵液的DPPH自由基清除率较高的有4#、9#、10#，分别为23.96%、25.96%、19.76%；菌体细胞提取物的DPPH自由基清除率较高的有1#、2#、4#、5#、9#，分别为33.04%、38.41%、41.07%、35.28%、33.21%。无菌体发酵液和菌体细胞提取物的DPPH自由基清除率均较高的为4#、9#。

综上所述，菌株4#、9#的抗氧化能力最强，且其菌体细胞提取物的抗氧化能力均高于无菌体发酵液，后续试验选择4#菌株作为出发菌进行研究。

2.4 抗氧化乳酸菌的培养基优化

2.4.1 不同碳源及碳源添加量对抗氧化能力的影响 选取抗氧化性较强的乳酸菌4#，分别接入不同碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉）和不同碳源添加量（15、20、25、30 g/L）MRS液体培养基中培养，测定无菌体发酵液对DPPH自由基清除率，结果如图2和图3所示。

由图2和图3可知，以葡萄糖为碳源时，无菌体发酵液对DPPH自由基清除率最高，达到21.36%；葡萄糖添加量为15 g/L，清除率达到最高，为47.5%，并随着添加量的增加，清除率缓慢下降后在20～25 g/L时急剧下降。故菌株4#最佳

碳源为葡萄糖，最佳添加量为15 g/L。

2.4.2 不同氮源及氮源添加量对抗氧化能力的影响 将乳酸菌4#分别接入不同氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）和不同氮源添加量（20、25、30、35 g/L）MRS液体培养基中培养，测定无菌体发酵液对DPPH自由基清除率，其结果如图4、图5所示。

由图4、图5可知，氮源为牛肉膏时，其无菌体发酵液对DPPH自由基清除率明显高于酵母膏和蛋白胨；同时，清除率随着牛肉膏添加量的增加而先增高后缓慢降低，在25 g/L时，DPPH自由基清除率最高，达到30.86%，故菌株4#最佳氮源为牛肉膏，最佳添加量为25 g/L。

2.4.3 不同pH值和装液量对抗氧化的影响 pH值和装液量是影响菌体生长的重要指标，将乳酸菌4#分别接入不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）和不同装液量（40、50、60、70 mL）MRS液体培养基中培养，测定无菌体发酵液对DPPH自由基清除率，结果见图6、图7。

由图6、图7可知，随着pH值上升，DPPH自由基清除率明显上升后下降；pH值为6时，清除率达到最高，为4758%，因此培养基的最优pH值为6。不同装液量的DPPH自由基清除率差异明显，随装液量的增加，DPPH自由基清除率先上升后下降，在装液量为60 mL时，DPPH自由基清除率最高为 42.57%，故菌株最佳装液量为250 mL三角瓶中60 mL。

综上所述，菌株4#的最佳培养基条件为：牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、柠檬酸氢二钠2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠5 g/L、硫酸锰0.25 g/L、硫酸镁0.58 g/L、吐温-80 1 mL/L，pH值为7，装液量为60 mL。

2.5 培养基优化验证试验

将菌株4#分别接入初始培养基和最佳培养基中，测定无菌体发酵液的抗脂质过氧化清除率、超氧阴离子清除率、DPPH 自由基清除率，比较培养基优化效果，其结果如表5所示。

由表5可知，优化后的无菌体发酵液的抗脂质过氧化率、超氧阴离子清除率稍有增高，DPPH自由基清除率明显增高，分别增加6.18、8.13、29.42百分点。结合3种清除率，优化后菌种的抗氧化能力有较大的增长，增量达到43.73百分点。

3 结论

以四川泸州老窖浓香型白酒酒糟为原料，采用稀释涂布法结合革兰氏染色、纸层析法分离乳酸菌，测定抗脂质过氧化率、超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率，以比较菌株抗氧化能力，并采用单因素试验进行培养基优化。结果表明：共得到12株乳酸菌，以抗脂质过氧化率、超氧阴离子清除率、清除DPPH自由基为抗氧化评价指标，菌株4#、9#抗氧化能力最强。采用单因素试验对4#培养基的碳源、碳源添加量、氮源、氮源添加量、pH值、装液量进行优化，其优化结果为牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值7，装液量为60 mL，且优化后4#抗氧化能力提高了43.73百分点，这为抗氧化菌株的生产应用、开发相关抗氧化产品提供一定的理论依据。同时，对于该菌株的培养条件优化以及工业应用还有待进一步探索。

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