HPLC法同时测定柠檬果实中11种类黄酮含量

涂勋良，阳姝婷，吴忠旺，吴传雪，张利，吕秀兰*



HPLC法同时测定柠檬果实中11种类黄酮含量

涂勋良1，阳姝婷1，吴忠旺2，吴传雪1，张利2，吕秀兰1*

(1.四川农业大学园艺学院，四川成都611130；2.四川农业大学理学院，四川雅安625014)

以四川安岳、云南瑞丽、广东河源的尤力克柠檬和重庆北碚的里斯本、北京柠檬、粗柠檬为材料，建立了HPLC法同时测定柠檬果实中11种类黄酮(橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、圣草枸橼苷、橙皮素、柚皮素、木犀草素、川陈皮素、圣草素、芦丁)含量的方法。结果显示：以乙腈–0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长287 nm，11种类黄酮在50 min 内完全分离，线性范围为0.010 0~100.000 0 μg/mL(R=0.999 9~ 1.000 0)，检出限为0.020~0.079 μg/mL，定量限为0.065~0.263 μg/mL，加标回收率为95.49%~103.10%，为0.81%~1.20%；6个供试材料果皮中的橙皮苷、圣草枸橼苷和芸香柚皮苷的含量分别在14.42~27.37、0.10~9.38、0.18~0.52 mg/g，以橙皮苷含量最高，其他8种成分的含量未超过0.50 mg/g或未检出；果汁中的橙皮苷和芸香柚皮苷的含量分别为6.64~7.42和0.03~0.15 mg/g，圣草枸橼苷的含量为0.03~0.17 mg/g(里斯本和北京柠檬未检出)，芦丁的含量在0.08~0.13 mg/g(里斯本未检出)，川陈皮素在四川安岳尤立克、里斯本和粗柠檬中的含量分别为0.05、0.06、0.06 mg/g，其他6种成分均未检出。结果表明，不同品种柠檬果实中类黄酮含量存在差异，不同产地的尤立克品种间的类黄酮含量也存在差异。

柠檬；类黄酮；高效液相色谱；同时测定

柑橘类黄酮是由一系列黄酮类化合物组成的功能化合物[1]，广泛存在于柠檬[2]、佛手[3]、柚类[4]、橙类[5]、宽皮柑橘[6]等各种柑橘的果实、花及叶中。类黄酮具有抗氧化[7]、抗炎[8]、抗癌[8]、抑菌[9]等多种生理活性，是植物化学研究的热点成分之一。柑橘果实中橙皮苷、柚皮苷和多甲氧基黄酮现已有农业标准[10-11]。迄今为止从柑橘中鉴定出的类黄酮单体有60余种，主要包括黄烷酮类、黄酮醇类和黄酮类[12]。在柠檬果皮中主要含有橙皮苷、圣草枸橼苷、芦丁、杨梅黄酮以及少量的柚皮芸香苷、柚皮苷、新橙皮苷，还有多甲氧基黄酮醇(如橙黄酮、川陈皮素、红橘素)等20多种类黄酮，而果汁中所含类黄酮种类仅比果皮少1种[2]。

高效液相色谱法（HPLC）是检测类黄酮含量的主要方法，具有高效、高灵敏度、快速、应用范围广等特点。张元梅等[13]采用HPLC对温州蜜柑、椪柑果皮和果肉中18种类黄酮进行了同时测定，发现不同柑橘品种和不同部位的类黄酮种类和含量存在一定差异。方波等[4]采用超高效液相色谱（UPLC）对10种柚类和柚杂种果皮、果肉中11种类黄酮进行了同时测定，发现不同柚品种、柚杂种果实类黄酮种类及含量差异显著，其累积规律与品种有关，杂种后代果实的类黄酮受其亲本影响。Caristi等[14]采用HPLC–DAD–MS–MS对意大利西西里岛的3个柠檬栽培种果汁中的圣草枸橼苷、橙皮苷和香叶木苷进行测定，发现3种柠檬果汁中的3种主要成分及其微量成分的含量存在差异。Peterson等[15–16]、Zhang等[17]发现酸橙以柚皮苷和新橙皮苷为主，甜橙和宽皮柑橘以橙皮苷和芸香柚皮苷为主，柠檬以橙皮苷和圣草枸橼苷为主，柚类则富含柚皮苷、芸香柚皮苷。目前少有文献比较不同柠檬品种中多种类黄酮含量.采用HPLC法对不同产地和不同品种柠檬果实中类黄酮物质组分和含量进行差异性比较分析，对完善和提高柠檬果实品质评价具有重要意义。

为了提高柠檬副产物的利用价值和加快柠檬产业化发展，本研究以6个来自不同产地和不同品种的柠檬为材料，选取11种类黄酮化合物(橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、圣草枸橼苷、橙皮素、柚皮素、木犀草素、川陈皮素、圣草素、芦丁)作为目标成分，建立了同时测定柠檬果品中11 种类黄酮化合物含量的HPLC法，研究不同柠檬果实中类黄酮种类及含量差异，旨在为柠檬类黄酮定量检测提供参考，为柠檬资源综合利用、资源评价及深度开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

以四川安岳尤力克柠檬、云南瑞丽尤力克柠檬、广东河源尤力克柠檬和中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔种质资源圃(重庆北碚)的里斯本、北京柠檬、粗柠檬为材料。

试剂：橙皮苷(纯度98.23%)、新橙皮苷(纯度99.35%)、柚皮苷(纯度99.00%)、芸香柚皮苷(纯度99.35%)、圣草枸橼苷(纯度99.00%)、橙皮素(批号纯度98.50%)、柚皮素(纯度98.50%)、木犀草素(纯度98.80%)、川陈皮素(纯度98.50%)、圣草素(纯度99.50%)、芦丁(纯度96.67%)标准品购自成都曼斯特生物科技有限公司，各标准品纯度均满足定量检测需求；乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司；甲酸(分析纯)购自成都科龙化工试剂厂；自制超纯水。

仪器与设备：LC–20AB型HPLC仪(日本Shimadzu公司)；LGJ–12冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；FW–80高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SB–600DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UPH–Ⅱ–20T超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)；BT124S电子天平(德国Sartorius公司)。­

1.2方法

1.2.1样品采集

试验于2015年进行。根据当地柠檬果实成熟状况适时采收，其中，安岳尤力克于10月22日采收；瑞丽尤力克于8月31日采收；河源尤力克与9月18日采收；北培里斯本、北京柠檬和粗柠檬于10月30日采收。每个品种选取5株生长势、树形基本一致的成年结果树，每株从树冠东、南、西、北、中5个方向各采5个同一成熟度的成熟果实，按品种进行混合，带回实验室，于−20 ℃冷藏。

1.2.2液相色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB–C18(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流速1.0 mL/min。检测波长为287 nm。以乙腈–0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱程序见表1。

表1　流动相梯度洗脱程序

1.2.3标准品溶液制备

精确称取橙皮苷5.00 mg、新橙皮苷5.02 mg、柚皮苷5.10 mg、芸香柚皮苷5.05 mg、圣草枸橼苷5.05 mg、橙皮素5.06 mg、柚皮素5.20 mg、木犀草素5.04 mg、川陈皮素5.03 mg、圣草素5.15 mg、芦丁5.07 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇(色谱纯)溶解并定容至10 mL，作为标准品储备液。采用梯度稀释法用甲醇(色谱纯)将各标准品储备液配制成一系列质量浓度的混合标准品溶液，−20 ℃保存，备用。

1.2.4供试样品溶液制备

参照Caristi等[14]的方法稍作改进。

柠檬果皮样品制备：分别随机选取各试样果实5个，剥离果皮和果肉，将果皮冷冻干燥至含水量小于5%，经FW–80高速万能粉碎机粉碎后，−20 ℃保存，备用。准确称取已制备好的果皮样品0.5 g置于50 mL带塞三角瓶中，加80%甲醇20 mL，超声提取2次，每次50 ℃、300 W、30 min。过滤，合并提取液，定容至50 mL，−20 ℃保存，备用。

柠檬果汁样品制备：将剥离后的柠檬果肉采用压榨法制取果汁，用双层纱布过滤后，−20 ℃保存，备用。准确吸取已制备好的果汁样品2.00 mL置于50 mL带塞三角瓶中，加入80%甲醇20 mL，超声提取2次，每次50 ℃、300 W、30 min。合并提取液，并定容至50 mL，−20 ℃保存，备用。

1.2.5方法学考察

1) 精密度试验。精确吸取混合标准品储备液，重复进样6次，以峰面积计算11种类黄酮的。

2) 稳定性试验。精确吸取安岳尤力克果皮供试品溶液，取10 μL分别于0、2、4、6、8、12和24 h后进样测定，以峰面积计算11种类黄酮的。

3) 重现性试验。精确吸取安岳尤力克果皮供试品溶液，重复进样6次，以峰面积计算11种类黄酮的。

4) 加标回收率试验。精确吸取已知11种类黄酮含量的安岳尤力克果皮供试品溶液，加入一定量的标准品储备液，重复进样6次，以峰面积计算11种类黄酮的加标回收率。

1.2.6供试样品的测定

柠檬果皮和果汁样品溶液测定前分别经0.22 μm微孔有机滤膜过滤，取10 μL按1.2.2的色谱条件进行分析，根据标准曲线分别计算果皮和果汁样品中11种类黄酮的含量。

2　结果与分析

2.1HPLC分析结果

11种类黄酮混合标准品的HPLC 色谱图见图1。在优化好的色谱条件下，混合标准品中各类黄酮成分分离度均大于1.8，分离效果极佳，且目标峰形尖锐，对称性好，因此本方法适合柠檬类黄酮化合物的测定。

1 圣草枸橼苷；2芦丁；3 芸香柚皮苷；4柚皮苷；5 橙皮苷；6 新橙皮苷；7 圣草素；8 木犀草素；9 柚皮素；10 橙皮素；11 川陈皮素。

以峰面积为纵坐标()，质量浓度为横坐标()，绘制标准曲线，由表2可见，圣草枸橼苷、橙皮苷等11种类黄酮标准品质量浓度和相应峰面积呈良好的线性关系，11种类黄酮的检出限为0.020~0.079 μg/mL，定量限为0.065~0.263 μg/mL。

表2　11种类黄酮的线性关系、检出限和定量限

2.2方法学考察结果

精密度试验结果显示11种类黄酮的峰面积为0.26%~0.51%，表明该方法精密度良好；24 h内测得11种类黄酮的峰面积均小于3.0%，表明该方法稳定性好。重现性试验结果显示11种类黄酮的峰面积均小于2.0%，表明该方法重现性好。由表3可见，11种类黄酮的加标回收率为95.49%~103.10%，为0.81%~1.20%，表明该方法具有较高的准确度。

表3　11种类黄酮回收试验结果

2.3供试样品类黄酮含量的测定结果

由表4可见，不同品种柠檬果实中类黄酮种类和含量差异明显。在6个柠檬品种中，橙皮苷含量最多，果皮含量为14.42~27.37 mg/g，明显高于果汁(6.64~7.42 mg/g)。果皮中橙皮苷含量由大到小依次为：瑞丽尤力克、北培里斯本、粗柠檬、河源尤力克、北京柠檬、安岳尤力克；果汁中橙皮苷含量远高于其他10种成分，橙皮苷含量由大到小依次为：瑞丽尤力克、河源尤力克、安岳尤力克、北培里斯本、粗柠檬、北京柠檬。圣草枸橼苷含量(果皮0.10~9.38 mg/g)次之，果皮中圣草枸橼苷含量由大到小依次为：瑞丽尤力克、河源尤力克、北京柠檬、安岳尤力克、粗柠檬、北培里斯本。芸香柚皮苷含量(果皮中为0.18~0.52 mg/g，果汁为0.03~0.15 mg/g)较少。其他9种类黄酮的含量均未超过0.50 mg/g，柚皮苷、新橙皮苷、圣草素、木犀草素、柚皮素、橙皮素在6个果汁样品中均未检出。

3　结论与讨论

Sun等[18]采用HPLC–PAD在波长280 nm下同时检测柑橘果实不同部分中的5种类黄酮，在35 min内完全分离；张元梅等[13]采用HPLC法同时检测柑橘果实中18种类黄酮，在42 min内完全分离。Goulas等[19]采用HPLC–DAD法同时检测柑橘果实中16种类黄酮，70 min内完全分离；Nogata等[20]采用HPLC–UV 法在波长285 nm下同时检测柑橘果实中17种类黄酮，在100 min内完全分离。本试验采用HPLC–UV 法，以乙腈–0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，在波长287 nm下同时检测不同品种柠檬果实中11种类黄酮，能在50 min内完全分离。该方法具有良好的精密度、重现性、稳定性及高回收率等特点，可作为柠檬样品中多种类黄酮含量测定的分析方法。

柑橘类黄酮研究已有大量报道，主要集中在橙类[15]、柚类[16–17]、宽皮柑橘[6，21]3大类，枸橼类(包括柠檬)研究相对偏少，尤其是不同品种间的比较。本试验对供试材料类黄酮的检测结果表明6个供试材料果实主要以橙皮苷、圣草枸橼苷为主，与Peterson等[16]和Wang等[22–23]所测结果一致。不同品种柠檬果实中类黄酮含量存在差异，可作为品种识别的重要依据。尤立克是目前国内的主要栽培品种，果实中的类黄酮含量高于里斯本、北京柠檬和粗柠檬3个品种，且3个产地的尤立克品种间也存在差异，这可能与生态环境、成熟度、采收期及采后储运等有关，具体原因有待进一步研究。

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Simultaneous determination of eleven flavonoids in different lemon () varieties by HPLC

Tu Xunliang1, Yang Shuting1, Wu Zhongwang2, Wu Chuanxue1, Zhang Li2, Lü Xiulan1*

(1.College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2.College of Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Eureka lemon from 3 different areas: Anyue county at Sichuan province, Ruili county of Yunnan province, Heyuan city at Guangdong province and 3 different varieties: Lisben, Mayer lemon and Rough lemon from Beibei region at Chongqing city were used as material, to establish a high performance liquid chromatograph (HPLC) method for the determination of 11 flavonoids, namely, hesperidin, neohesperidin, naringin narirutin, eriocitrin, hesperitin, naringenin, luteolin, nobiletin, eriodictyol and rutin in lemon fruits simultaneously. The results showed that 11 flavonoids were thoroughly separated within 50 min under the condition of using acetonitrile–0.1% formic acid aqueous solution as mobile phase through gradient elution and the detection wavelength was 287 nm. This method exhibited a linear range from 0.010 0 to 100.000 0 μg/mL (the correlation coefficient was from 0.999 9 to 1.000 0). The limits of detection ranged from 0.020 to 0.079 μg/mL, and the limits of quantification ranged from 0.065 to 0.263 μg/mL. The recoveries ranged from 95.49% to 103.10% withbetween 0.81% and 1.20%. Hesperidin was the major flavonoid in six lemon varieties. Content of hesperidin, in six varieties peels was from 14.42 to 27.37 mg/g, eriocitrin was from 0.10 to 9.38 mg/g and narirutin was from 0.18 to 0.52 mg/g. Other 8 compounds in peels was less than 0.50 or not detected. Content of hesperidin in six varieties juice was from 6.64 to 7.42 mg/g, and Content of narirutin was from 0.03 to 0.15 mg/g, content of eriocitrin in juice was from 0.03 to 0.17 mg/g and not detected in Lisben and Mayer lemon, content of rutin in juice was from 0.08 to 0.13 mg/g and not detected in Lisbon from Beibei district at Chongqing, content of nobiletin was 0.05, 0.06 and 0.06 mg/g in juice of Eureka from Anyue county at Sichuan province, Lisben and Rough lemon from Beibei district at Chongqing, other 6 compounds were not detected. The results indicated that the content of flavonoids existed difference in different lemon varieties and Eureka lemon from different areas.

lemon; flavonoids; high performance liquid chromatography (HPLC); simultaneous determination

TS255.1；S666.5

A

1007-1032(2016)05-0543-06

2016–03–28

2016–07–25

国家现代农业产业技术体系四川创新团队专项资金项目；四川省科技支撑计划项目(2013FZ0036)

涂勋良(1987—)，男，重庆綦江人，博士研究生，主要从事果树栽培理论与技术研究, txl0103@163.com；*通信作者，吕秀兰，教授，主要从事果树学研究，xllvjj@163.com

投稿网址：http://xb.ijournal.cn

责任编辑：尹小红

英文编辑：梁和