心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠的降压作用和对靶器官损伤的影响

王丽，丁玲，胡娟，胡正帅，高杉

(安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥　230032)



心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠的降压作用和对靶器官损伤的影响

王丽，丁玲，胡娟，胡正帅，高杉

(安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥230032)

目的探讨心肌尔康对一氧化氮合酶抑制剂L-NAME诱导高血压小鼠心血管重构的影响。方法实验分为正常组、模型组、心肌尔康组。每周测小鼠尾动脉压，实验第8周末，处死小鼠，计算小鼠心脏指数、肺重指数，HE染色和V-G染色观察心脏、胸主动脉病理形态学改变。测定小鼠血浆NO含量。结果与正常组相比，模型组血压明显升高(P<0.01) ，心脏指数、心肌细胞横截面积、心肌纤维化明显升高，胸主动脉发生明显重构。血浆NO含量降低；与模型组相比，心肌尔康能明显降低L-NAME诱导的高血压小鼠的血压(P<0.01)，升高NO含量，改善心血管重构。结论心肌尔康能明显抑制L-NAME诱导小鼠血压的升高，改善心血管重构。

高血压;一氧化氮合酶;中草药;治疗结果;小鼠

高血压是临床的常见病、多发病，是严重危害人民群众健康的重大公共安全事件，常导致心、肺、肾等靶器官损害。心血管作为最重要的高血压靶器官，其损伤主要表现为心血管重构，如心肌细胞肥大、心肌纤维化、心室肥厚等。一氧化氮(NO)是人体内一个重要的气体信号分子，参与多种生理活动，对机体心血管系统的稳态的维持起着重要作用。病理情况下NO合成释放减少，将导致一系列心血管疾病的发生和发展，如高血压、冠心病等[1]。文献报道[2],一氧化氮合酶催化L-精氨酸合成NO，而竞争性NO合酶抑制剂L-NAME，可抑制NO的合成和释放，进而导致实验动物血压进行性升高，是一种常用的高血压实验动物模型[3]。心肌尔康是安徽中医药大学名老中医王乐陶教授总结多年临床经验研制的临床验方，由人参、黄芪、麦冬、玉竹等十四种中药材组成，具有滋阴养心，活血养血。临床和基础研究均表明该方对心脏有保护作用，如对冠心病、病毒性心肌炎有明显疗效[4-5]。本研究通过建立L-NAME诱导的高血压动物模型，观察心肌尔康的实验治疗作用，为心肌尔康的临床应用、揭示其作用机制提供进一步的理论依据和实验数据。

1　材料与方法

1.1动物模型制备和分组清洁级雄性昆明小鼠30只，体重18～23 g，随机分为3组，每组10只。实验结束时，每组分别死亡若干只，所以每组最终的样本量有所差别。根据文献报道[6-7]和前期实验条件摸索复制L-NAME诱导高血压小鼠模型，正常组接受普通饮食饮水，模型组和心肌尔康组中加入L-NAME(2 g·L-1)，连续给药8周，心肌尔康组自第5周起每天灌胃给予心肌尔康12 g·kg-1，每天1次，连续4周。

1.2药物及仪器心肌尔康水提浸膏干粉由合肥七星医药科技有限公司所制备。NO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，批号：20150119；JA123电子天平购自上海精天电子仪器有限公司；TDZ4-WS低速台式离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；ALC-NIBP无创血压测量分析系统，上海奥尔科特生物科技有限公司。

1.3测量指标

1.3.1动态血压测量

采用无创尾动脉测压法检测小鼠清醒状态下的尾动脉收缩压，每周1次，每只小鼠测量7～8次，取平均值作为当周小鼠的收缩压。

1.3.2心重指数、肺重指数的测定

8周称重，10%水合氯醛(0.05 mL·10 g-1)腹腔注射麻醉。颈动脉插管取血。取完血后，迅速打开胸腔取出心脏、肺、胸主动脉。剥离心脏周围胸腺和结缔组织，滤纸吸干后称量心脏重量(Heart weight,HW)，计算心脏指数(HW/BW)；肺同上，计算肺重指数(LW/BW)。

1.3.3心脏病理学观察

10%福尔马林溶液灌流心脏15 min、 固定，然后脱水、包埋，制成蜡块，4 μm连续切片，切片在60℃烘箱中脱蜡，行HE和V-G染色，树脂封片。借助Nikon Eclipse 80i进行图像采集，根据我们之前报道的方法[8-9]，ImageJ1.61计算心肌细胞横截面积(CSA)、心肌间质胶原容积分数(CVF)和血管周胶原容积分数(PVCA)。其中，PVCA=血管周围胶原面积/血管及管腔总面积，CVF=心肌间质胶原面积/心肌间质总面积。

1.3.4胸主动脉病理学观察

剥离胸主动脉与周围的结缔组织，10%福尔马林溶液固定、脱水、包埋、制蜡、切片,同心脏染色方法。显微镜观察采集图片，借助软件ImageJ1.61分析计算血管总面积(TAA)、管腔面积(LA)、血管外径(AD)、血管内径(LD)、中膜厚度(MT)。

1.3.5血浆中一氧化氮(nitric oxide，NO)含量的测定

2　结果

2.1心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠血压的影响如图1所示，三组小鼠初始血压值各组间差异无统计学意义，给L-NAME后，与正常组相比，模型组小鼠血压明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，4周后，血压上升平缓；从第五周起经心肌尔康药物治疗4周后，与模型组相比，心肌尔康组小鼠血压明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与对照组相比，aP <0.01；与模型组相比，bP<0.01 。

2.2心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠心脏重量指数(HW/BW)、肺重指数(LW/BW)的影响与正常组相比，模型组HW/BW明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；经心肌尔康治疗后，与模型组相比，心肌尔康可明显抑制HW/BW的升高，抑制心肌肥厚，改善心室重构，差异有统计学意义(P<0.01)，各组之间LW/BW比值差异无统计学意义。见表1。

2.3心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠心肌肥大及纤维化的影响HE染色和V-G染色结果显示，与正常组相比，模型组CSA明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；经心肌尔康治疗后，能明显降低模型组CSA，差异有统计学意义(P<0.01)。V-G染色后，心肌组织呈黄色，胶原纤维显红色。与正常组相比，模型组胶原纤维明显增多，CVF、PVCA明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，心肌尔康组纤维化程度降低，CVF、PVCA明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2及图3。

表1　心肌尔康对L-NAME高血压小鼠BW,HW,LW,HW/BW,LW/BW的影响

注：与正常组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01 。

注：A：心肌细胞横截面积代表图(HE×400)；B：心肌细胞纵径代表图(HE×400)；C：心肌细胞横截面积(CSA)统计图。1：正常组；2：模型组：3：心肌尔康组。与正常组相比，aP <0.01 ；与模型组相比，bP<0.01 。

2.4心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠主动脉环重构的影响如表2，图4所示，与正常组相比，模型组小鼠主动脉的TAA、CSA均明显增加，表明L-NAME诱导高血压小鼠主动脉发生明显重构(P<0.01、P<0.05)；经心肌尔康治疗后，TAA、CSA均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示心肌尔康可明显改善主动脉重构。

2.5心肌尔康对L-NAME诱导高血压小鼠血浆NO含量的影响图5结果显示，与正常组相比模型组小鼠血浆NO含量较正常组明显降低(P<0.01)，给予心肌尔康实验治疗后，心肌尔康可明显抑制血浆中NO含量的降低(P<0.05)。

注：A：心肌间质胶原VG染色代表图(×400)；B：心肌血管周围胶原VG染色代表图(×400)；C：心肌间质胶原容积分数(CVF)；D：心肌血管周胶原容积分数(PVCA) 。1：正常组；2：模型组；3：心肌尔康组。与正常组相比，aP<0.01 ；与模型组相比，bP<0.01。

注：1：正常组；2：模型组；3：心肌尔康组。

注：1：正常组；2：模型组；3：心肌尔康组。与正常组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05。

表2　心肌尔康对L-NAME高血压小鼠主动脉重构的影响±s)

注：TAA：动脉总面积；LA：动脉内管腔面积；CSA：动脉横段面积；AR：动脉外管腔半径;Media：中膜厚度。与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组相比，cP<0.05。

3　讨论

内皮细胞是覆盖于脉管系统内层的单层细胞，正常的内皮细胞排列规则，能够通过产生一系列的生物活性因子对血流切应力、外界物理和化学信号产生响应。内皮细胞不仅通过产生和释放几种血管活性分子舒张或收缩血管，还能对血管中的其它活性物质如缓激肽和凝血酶产生应答和修饰，共同参与血管张力的维持。

L-NAME是一种非选择性的NOS抑制剂，长期给予实验动物L-NAME后， 使内皮依赖性NO生成、释放减少[10]，进而导致血管内皮细胞损伤，影响其舒血管效应从而导致实验动物血压升高，是一种经典的高血压实验动物模型[11]。有研究表明,经L-NAME处理后，心肌中NO含量降低,AngⅡ的含量升高，表明心肌局部NO与AngⅡ含量的变化参与了高血压及心室重构的形成[12]。研究认为[13]心脏局部组织中的肾素-血管紧张素-醛固酮系统参与了心室重构过程。AngⅡ与NO具有相反的血管作用，在高血压动物模型中它们也存在相反的血管及细胞增殖反应，如影响血管中膜厚度、炎性细胞浸润等变化[14]。因此AngⅡ的升高除了收缩血管而导致血压升高外，还可产生心脏血管重构效应，而长期的心血管重构是心脑血管终点事件的独立危险因素。本实验结果表明，与对照组相比，模型组实验动物饮水中加入NOS抑制剂，连续4周后即可形成稳定的高血压(P<0.01)，提示造模成功。心肌尔康是安徽中医药大学王乐陶教授总结多年临床经验形成的一剂临床验方，本实验结果表明，心肌尔康能明显降低模型组的血压(P<0.01)，改善心血管重构，其机制可能与提高血清中NO含量、改善内皮细胞功能紊乱有关。

本实验初步揭示了心肌尔康对L-NAME诱导高血压实验动物模型的药理学效应和部分机制，而有关其量效关系和深入的分子机制本课题组正在进一步研究中。

[1]Garza AE,Pojoga LH,Moize B,et al.Critical role of striatin in blood pressure and vascular responses to dietary sodium intake [J].Hypertension,2015,66(3):674-680.

[2]Park HC,Yasuda K,Ratliff B,et al.Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted [J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(2):357-364.

[3]Moreau P,Takase H,Küng CF,et al.Blood pressure and vascular effects of endothelin blockade in chronic nitric oxide-deficient hypertension[J].Hypertension,1997,29(3):763-769.

[4]高杉，汪星辉，黄玲玲,等.心肌尔康对异丙肾上腺素致小鼠心室重构的保护作用及其机制 [J].中西医结合学报,2012,10(3):330-336.

[5]汪远金,江安宏,王钦茂,等.心肌尔康冲剂对阿霉素致中毒性心肌炎小鼠心肌酶和MDA 含量、SOD 活性影响 [J].安徽中医学院学报,2001,20(3):43-45.

[6]Zhang Y,Carreras D,de Bold AJ.Discoordinate re-expression of cardiac fetal genes in N(omega)-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) hypertension[J].Cardiovasc Res,2003,57(1):158-167.

[7]Boe AE,Eren M,Murphy SB,et al.Plasminogen activator inhibitor-1 antagonist TM5441 attenuates Nω-nitro-L-arginine methyl ester-induced hypertension and vascular senescence[J].Circulation,2013,128(21):2318-2324.

[8]Gao S,Long CL,Wang RH,et al.K(ATP) activation prevents progression of cardiac hypertrophy to failure induced by pressure overload via protecting endothelial function[J].Cardiovasc Res,2009,83(3):444-456.

[9]Hooper CL,Paudyal A,Dash PR,et al.Modulation of stretch-induced myocyte remodeling and gene expression by nitric oxide:a novel role for lipomapreferred partner in myofibrillogenesis[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2013,304(10):1302-1313.

[10] Yorsin S,Kanokwiroon K,Radenahmad N,et al.Effects of Kaempferiaparviflora rhizomes dichloromethane extract on vascular functions in middle-aged male rat [J].J Ethnopharmacol,2014,156:162-174.

[11] Lüscher TF.Imbalance of endothelium-derived relaxing and contracting factors.A new concept in hypertension [J].Am J Hypertens,1990,3(4):317-330.

[12] Der Sarkissian S,Tea BS,Touyz RM,et al.Role of angiotensin II type 2 receptor during regression of cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats [J].J Am Soc Hypertens,2013,7(2):118-127.

[13] Husarek KE,Katz PS,Trask AJ,et al.The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice[J].Vascul Pharmacol,2016,76:28-36.

[14] Der Sarkissian S,Tea BS,Touyz RM,et al.Role of angiotensin II type 2 receptor during regression of cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats[J].J Am Soc Hypertens,2013,7(2):118-127.

Effect of Xinjierkang on anticardiovascular remodeling inL-NAME induced hypertension mice

WANG Li,DING Ling,HU Juan,et al

(DepartmentofPharmacology,BasicMedicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Xinjierkang(XJEK) onL-NAME induced hypertension and cardiovascular remodeling in mice.MethodsMice were assigned into control group,model group,and Xinjierkang group,At the end of 8thweek,the mice were euthanatized and the heart,lung and thoracic aorta were harvested,The heart weight/body weight(HWI),lung weight/body weight(LWI) were calculated,respectively,HE staining and/or V-G staining were used to detect cardiac and thoracic aortic pathological changes,Colorimetric analysis was used to assay nitric oxide(NO) in plasma.ResultsCompared with control group,the systolic blood pressure,HWI,LWI,cross-sectional area of cardiomyocytes,myocardial fibrosis were significantly increased(P<0.01),as well as marked thoracic aortic remodeling,decreased plasma NO content,Administration with XJEK markedly inhibited the elevation of systolic blood pressure,HWI and LWI,which blunted the decrease of NO plasma content,ameliorated cardiovascular remodeling.ConclusionsXJEK has protective effects against cardiovascular remodeling inL-NAME induced hypertensive mice.

Hypertension;Nitric oxide synthase;Drugs,chinese herbal;Treatment outcome;Mice

国家自然科学基金(81373774)

王丽，女，硕士研究生

高杉，男，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，E-mail:aydgs@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.007

2016-03-11，

2016-06-08)