基于微流控芯片技术的秀丽隐杆线虫研究进展

尹方超, 温 慧, 朱国丽, 秦建华*

(1. 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023; 2. 中国科学院大学, 北京 100039)



专论与综述

基于微流控芯片技术的秀丽隐杆线虫研究进展

尹方超1,2, 温 慧1, 朱国丽1, 秦建华1*

(1. 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023; 2. 中国科学院大学, 北京 100039)

秀丽隐杆线虫具有体积小、生命周期短、结构简单和高基因保守性等特点,是生命科学研究领域中的一种重要模式生物。微流控芯片的通道尺寸与线虫大小相匹配,并可实现灵活集成的线虫操控,为线虫研究提供了一种全新的平台。在微流控平台上,线虫长期培养、固定、分选、精确刺激传递和单线虫包裹等单元操作已经实现,并被应用于线虫神经生物学、行为学、衰老及发育、药物筛选等研究中。该文着重介绍近几年基于微流控芯片技术的线虫研究最新进展,并对其应用前景予以展望。

微流控芯片;秀丽隐杆线虫;液滴;综述

1 秀丽隐杆线虫简介

模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,简称C.elegans)是一种微小的多细胞无脊椎动物,在自然情况下自由生活在土壤间水层中,以细菌为食,是一种经典的模式生物。

线虫的基本特征表现为:通体透明,培养简单,可直接在显微镜下观察其体内器官;体积小(成虫体长仅1 mm,直径50 μm),生命周期短(仅3天),野生型线虫株N2在20 ℃可存活约20天;雌雄同体,细胞定数(雌雄同体959个,雄性1 031个)[1];神经系统结构简单(302个神经元),却含有编码脊椎动物大脑相关的多数基因,与人类在受体、神经递质等方面明显相似;线虫的基因测序已全部完成,可提供线虫的全部遗传信息,现已知线虫基因组约相当于人基因组的1/30,但几乎所有重要的人类发育和疾病基因都在线虫中存在直向同源基因且相关信号通路保守[2]。这些独特的生物学和遗传学特征使线虫成为在基因组规模上研究人类信号传导路径,以及在活体内进行药物评价的最佳模式生物之一。

自1963年科学家Sydney Brenner[3]进行首次以线虫为研究对象的开创性研究以来,它被广泛应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学和神经生物学等领域[4,5]。发展至今,很多科学家利用线虫开展了一系列具有里程碑意义的工作。Brenner、Sulston和Horvitz 3位生物学家因在线虫遗传发育和细胞凋亡方面的成就而获得2002年诺贝尔生理及医学奖[1], Fire和Mello因在线虫RNA干扰(RNAi)及其遗传机制方面的成就获得了2006年诺贝尔生理及医学奖[2]。线虫也已被广泛用于多条基因信号通路的研究,研究发现胰岛素/类胰岛素样生长因子-1(IIS)信号通路对线虫应激耐受、发育、寿命、免疫都具有调控作用,是调控线虫衰老的重要通路之一,且在更高等的生物包括人类中高度保守[6]。综合以上,线虫这一生物学模型在神经生物学、遗传与发育学、衰老与寿命、人类遗传性疾病等研究领域发挥着重要作用。

2 传统线虫培养方式与研究手段

目前线虫研究主要在液体或琼脂板上进行,即通常使用移液枪手工将线虫培养于96孔板内的液体培养基(K medium、S medium)或NGM(Nematode growth medium)琼脂培养基上,在培养过程中定期更换孔板或琼脂板。在对线虫行为进行研究时,需经过线虫大量培养、刺激施加、清洗、分选和检测等多个步骤,分析线虫行为响应;分析线虫的荧光成像特征时,研究者必须用铂金铲将单个线虫手工挑取出来,再用胶水或麻醉剂固定线虫,才能满足荧光成像的要求。显而易见,基于传统的研究手段,线虫培养群体数量多,但是试剂和耗材消耗量大,操作步骤较为繁琐、复杂,费时费力,通量低,难以对单个线虫实现精确的刺激传递、操控和追踪,且成像时固定线虫所用的胶水或者麻醉剂可能会对线虫的神经和行为产生一些潜在的副作用[7]。

整体而言,随着线虫相关研究的发展,当前模式生物技术的发展远不能满足现代生物医药研发的需要。建立一种通量更高、更易于实现单线虫精确操控的新型研究平台,实现药物评价的微型化和集成化是未来发展的趋势。

3 微流控芯片线虫研究介绍

微流控芯片又称为芯片实验室(Lab-on-a-Chip),是一种以在微米尺度空间对流体操控为主要特征的技术,它以微通道形成网络,以可控流体贯穿整个系统,可以实现常规化学或生物实验室的各种功能,具有微型化、自动化、集成化、高通量以及可以在接近生理环境下运行等特点。

相对传统线虫研究手段,微流控芯片具有很多不可比拟的优势:尺寸为微米至毫米级,可以与各个生长期的线虫大小相匹配;它能通过流体在微通道内实现对微小物体及其所处微环境的精确操控,因此可实现精确的刺激传递;易于实现高通量,可以满足大规模单线虫个体分析的要求;具有设计灵活、高度自动化和集成化的特点,有利于根据研究需要对线虫进行大规模筛选及多参数实时监控。

鉴于微流控芯片用于线虫研究具有诸多优势,目前已经有很多研究者致力于这一交叉学科的研究。本文将从微流控芯片线虫操控方法及其应用两方面进行综述。

3.1 微流控芯片线虫操控方法

基于线虫特点,芯片线虫操控方法主要包括线虫培养、固定、分选、精确刺激传递及液滴包裹等。研究者们通过灵活的微结构设计和流体控制实现了精确的线虫操控。

3.1.1 线虫培养

线虫培养是开展线虫衰老及发育或其他需要长时间培养及观察研究的前提和基础。线虫长期生存的最基本条件为充分的物质交换,包括氧气和食物。微流控芯片中可运用灵活的流体操控实现对线虫食物的添加和代谢物的排出,而常用的芯片制作材料聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)具有良好的透气性,可保证线虫培养环境中有充足的氧气,因此适于进行线虫的长期培养[8-13]。Kim等[8]设计了一种基于离心力原理的CD形线虫培养微流控芯片,该设计使液体自动在芯片通道中流动,可以实现线虫的自动培养和行为检测,并对隔离开的同一基因型的3代线虫进行研究。本课题组温慧等[12]设计了一种以圆盘状微通道多维网络排列为基本框架的微流控芯片,利用对两个微阀的控制实现了单个线虫的进样、加药、观察及固定成像过程,可实现最长33天的培养时间。Kopito等[13]提出了一种基于Worm Spa人体工学的微流体线虫培养室(ergonomic microfluidic chambers forC.elegans)的线虫培养方法,Worm Spa可以使线虫在一定的时间内(>24 h)维持正常的生理功能,用该方法可以监测改变外界环境对线虫的生理过程的影响。

3.1.2 线虫固定

线虫固定对线虫成像以及神经元的研究起着至关重要的作用,常规线虫固定操作中使用的胶水或麻醉剂都可能对线虫产生一些副作用,并且很难追踪特定线虫荧光特征的变化,因此如何实现无损伤、高通量、可逆的线虫固定是亟待解决的问题。微流控芯片由于其结构和流体设计的灵活性,可以为线虫固定提供多种新的解决方法,目前微流控芯片上成熟的线虫固定方式主要有机械法、凝胶法、温控法等,如图1所示。

图 1 微流控芯片上的多种线虫固定方法Fig. 1 Different methods for worm immobilization in microfluidic devices a. tapered channels[14]; b. deformed polydimethylsiloxane (PDMS) membrane[15]; c. CO2 stream or by pressurizing the immobilization channel[16]; d. suction[17].

3.1.2.1 机械固定法

机械法固定线虫是使用最为广泛的一种线虫固定方法,其主要利用通道结构的设计对线虫进行有效固定,目前使用的方法为楔形通道挤压、PDMS膜形变和侧阀抽吸等。这种固定方式具有良好的可逆性和可操作性,同时避免了胶水和麻醉剂的副作用,并且可以实现对单个线虫的可逆无损固定,相关研究者在这方面开展了许多研究工作[14-34]。

Hulme等[14]设计并制作了一个包含128个楔形通道的微流控芯片,这些楔形通道共用一个线虫入口,128个分支通道将线虫引入各个通道,利用此装置可实现线虫的快速高通量固定(15 min内固定超过100条),并通过研究发现该固定方法对线虫无明显伤害。有些研究者[19]用楔形通道固定线虫并对线虫单个神经元进行了激光烧蚀手术,实现了线虫的长期荧光成像及对神经元发育的长期观察,证明利用楔形通道固定线虫具有稳定性和可靠性。

PDMS膜形变法是将PDMS膜封接在液路层和气路控制层中间,在气体的正压力下,PDMS膜向液路层发生形变,使线虫身体在压力下被挤压并固定在液路成像通道的一侧;撤销压力后,PDMS薄膜在自身弹力的作用下恢复原状,通道重新通畅,被固定的线虫得以释放。Guo等[15]和Zeng等[26]利用这种方法实现了线虫的固定,实验结果证明与麻醉固定法相比,机械固定线虫法改善了线虫神经元再生的速度。本课题组温慧等[12]、马慧等[20]设计并制造了一系列基于微阀的单线虫固定阵列,一次运行可以同时对多个线虫进行固定或释放操作,极大地提高了实验的运行速度和通量。

Rohde等[17]发明了一种基于吸力的微流控操控技术对线虫进行固定,该装置的核心技术是在微通道一侧制作微柱阵列形成空隙,并施加真空负压,将经过的线虫吸在通道侧壁上使其横向固定,撤去真空后线虫可在流体的推动下被冲走进行下一步分选。刘笔锋课题组[21]利用此技术对线虫进行固定并实现了显微注射。

有些研究人员把上述几种方法进行联用,设计了一系列可以极其稳定地进行线虫固定的方法,如利用微阀组成的芯片将线虫固定于微通道中[23],以及将微通道和吸力集于一体对线虫进行头部的局部固定,以便研究线虫咽喉的EPG(electropharyngeogram)信号[24]。机械法固定线虫的优点是操作简单、效果稳定,但是如果尺寸过小会增大制作的难度,所以通常用于成虫的固定成像,难以实现对幼虫的固定。

3.1.2.2 凝胶固定法

目前用于凝胶法固定线虫的主要是一种凝胶敏感性材料Pluronic F127(PF127),它低温下凝固成凝胶状态,高温下溶解成液体,并且具有良好的生物相容性,透明无毒,易于操控且其操作温度与线虫的生存温度相近,可以用于芯片上的线虫固定和相关研究[10,28,29]。Krajniak等[28]利用温度敏感凝胶PF127的凝胶状态固定线虫,并用纳米磁珠填充线虫培养室中的剩余空隙,使线虫运动受到限制,从而更有效地实现线虫固定。一些研究者[29]将L1期线虫包裹在PF127液滴中,实现了精确的L1期单线虫操控,然后使PF127转化为凝胶态使包裹在其中的L1期线虫被暂时性固定,从而实现L1期单线虫高分辨率成像,此平台可用于各个发育期的线虫。但是由于凝胶需要的转变时间较长,不适用于高通量的应用研究。

3.1.2.3 温控固定法

线虫对温度具有一定的敏感性,会在过低或者过高的温度下失去运动能力。利用线虫这一行为特征,研究人员[30]构建了一个带有温度控制的微流控装置,利用冷却的循环液体和PDMS薄膜的导热性,可以在短时间内将温度变化传递给线虫。当线虫的身体温度降到4 ℃左右,就可以有效固定线虫进行高分辨成像,为后续的突变分选提供了一个有效的操作平台。另外也有研究者[31]利用温度高于31 ℃时线虫会丧失神经元活性导致无法运动这一特点,构建了集成电极的芯片,对线虫所处环境施加光电刺激,利用电极加热使线虫周围温度升至31 ℃左右,从而使线虫失去运动能力;成像后去除光电刺激,线虫可恢复运动。低温固定线虫具有高通量、易操控的优点,但不能进行长期固定,而高温可能会对线虫的神经有损伤,所以温控法固定线虫在应用方面有一定的局限性。

除了以上几种常用的线虫固定方法,近几年研究者还发展了利用高浓度CO2[16,32]、声波[33]、电场[34,35]等固定线虫的方法。例如一些研究者利用PDMS薄膜的透气性,在气路中通入CO2气体,随着CO2透过PDMS膜向液路层的扩散,线虫所在液体中的氧气逐渐被CO2替代,使线虫因受到麻痹而被固定,可固定线虫1～2 h。该方法可用于需要长期固定的实验,为神经细胞再生长和细胞发育等研究提供了技术平台[32]。目前在微流控芯片上固定线虫的这些方法各有利弊,机械法芯片结构比较简单,线虫还会有局部的身体活动,且不会对线虫造成明显的神经损伤,但不能固定线虫整个身体使它完全不动,故在高分辨成像操作上存在不足;而温控法和凝胶法可以解决这方面的问题,但是由于外源的化学物质或温度刺激可能会对线虫的神经系统带来一些不可预知的损害,所以如何针对线虫进行高分辨无损固定成像还需要进一步的研究。

3.1.3 线虫分选

不同发育阶段的线虫在物理和化学因素刺激下,会在神经和行为方面有不同表现。根据这些特征分选线虫对进一步的研究有着重要的意义,因此构建快速、准确的线虫分选方法至关重要,但商品化的线虫分选仪器庞大且昂贵,不适于常规实验室配备。利用微流控芯片灵活的结构或流体设计,可巧妙地分选不同发育期的线虫。目前微流控芯片上线虫分选主要依据电场[36-40]、流体[12,14,19,18,30,41-46]和微阀[15,20,23,47-49]控制。

研究者[40]利用不同发育期线虫的电趋性不同设计了一种分选通道对称的微流控芯片,可同时分选不同成长期和尺寸的线虫。也有一些研究者[41]设计了一个集光纤检测器和层流切换的高通量连续流的线虫分选设备。如图2所示,Lu课题组[42]设计了一个基于线虫尺寸来进行分选的简单、准确且高通量的微流控芯片平台,这种分选方法跟线虫的发育阶段密切相关。芯片包括优化的几何柱阵列,这个阵列只允许特殊尺寸的线虫快速通过。通过优化培养室高度、柱子的间距以及驱动压力,这个二维的分选设备分离两个发育阶段的线虫的平均效率为95%,且每分钟能够分离几百条线虫。如果将4个设备串联使用,分离混有所有阶段线虫的效率达到85%以上。一些研究者利用微阀构建了一种可以实现自动定位的微流控芯片系统,该芯片可以根据线虫的突触特征进行快速分选,准确率高达96.5%[23]。

传统的线虫分选方式具有效率低和准确率低的缺点,而微流控芯片由于高集成的特点,可以实现高通量的线虫分选,并且极大地提高了准确率和分选速度,为准确、高效的线虫分选提供了新的平台。

图 2 基于线虫尺寸进行线虫分选的方法[42]Fig. 2 Size based separation of C. elegans developmental stages on a high-throughput device[42] a. chip design; b. operating procedure for sorting two worm populations; c. schematic of four optimized devices set up in sequence for sorting a worm mixture of all developmental stages; d. plot of purity for sorted worms.

3.1.4 精确刺激

线虫具有简单但完整的神经系统,可以感受微小的物理或化学刺激,并且做出相应的响应,这对线虫的行为及神经研究至关重要。通过对微流控芯片的灵活设计及准确的流体操控,可以将微小刺激精确传递给单个线虫。已有许多研究者通过芯片将微小刺激精确传递给线虫,并研究其相应的神经活动和行为[50-56]。如图3所示,Zimmer等[51]设计了一种多层的微流控芯片,在上层气路中通入O2, O2通过中间PDMS膜渗透进液路层中并传递给线虫,通过固定线虫进行荧光成像,监测线虫BAG感觉神经元对不同浓度O2的响应。一些研究者[53]设计了一种集自动操控线虫、无损伤固定线虫、可控刺激于一体的微流控芯片,利用线虫鼻尖处的化学感应纤毛来感应化学刺激,进而研究线虫对各种化学刺激的响应。

图 3 微流控芯片上的微环境构建Fig. 3 Microenvironment construction on microfluidic chip a. magnification view of the PDMS imaging chip, with worm nose exposed to buffer or odour[52]; b. layout and cross section of the microfluidic worm channel (red) and the overlying O2 flow chamber (blue)[51]. (The surrounding gray shaded box represents PDMS cast. Image at top shows an animal in the channel.) AWC: olfactory neurons; AIB, AIY, AIZ, AIA: interneurons.

另外,研究者还可以对芯片进行不同的设计,观察线虫对物理环境的响应。例如Park等[54]制作了一种琼脂微柱阵列来模拟线虫的实际生活环境,研究了线虫的运动行为。王文会课题组[56]设计了几种不同的PDMS微柱阵列作为力量传感单元,研究了线虫的肌肉力量和运动行为。与传统方法相比,微流控技术为线虫提供了单线虫精确刺激的方法,可以用于线虫相关的药物筛选和研究。

3.1.5 液滴单线虫捕获

液滴微流控芯片是微流控芯片的另一种形式,两种互不相溶的液体在表面张力和流体剪切力的作用下,以其中的一种作为连续相,另一种作为分散相,分散相以微小体积单元的形式存在于连续相中,从而在芯片通道内形成连续、高通量的单分散性液滴。每一个液滴体积通常为纳升至飞升级,具有耗样低、通量高、操控简单、无交叉污染等特点,因此可作为一个微反应器,用来研究微尺度上的生物、化学反应及其过程,也成为研究线虫的又一有力平台。尤其是在研究尺寸较小的线虫幼虫时,可克服小尺寸微流控结构制作时的难度,将利用简单的液滴形成技术将单个线虫从群体中分离出来,达到单线虫高通量操控的目的。液滴微流控芯片与通道微流控芯片相比具有不可比拟的优点,已有不少研究者设计了不同的液滴微流控芯片进行线虫研究[11,57-60]。本课题组也构建了多种微流控芯片平台,实现了单线虫的包裹、运动行为和荧光特征监测。

图 4 一种用于单线虫捕获的液滴微流控芯片[58]Fig. 4 A droplet-based microfluidic system for individual C. elegans assay[58] a. schematic diagram of the droplet-based microfluidic device; b. image of 24 array droplets encapsulated with worms.

本课题组[58]设计并制作了一系列集成化的液滴微流控芯片,将液滴微流控芯片引入线虫研究,如图4所示,该工作以微液滴作为单线虫的微储存器,考察了不同浓度神经毒素MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)的活性代谢产物MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)对单个线虫运动行为的影响,显示了将高通量液滴用于单线虫研究的前景。在此基础上又构建了一个集成化双层液滴微流控芯片[59],该芯片采用一种利用浮力进行液滴捕获的全新技术,并增加了与液滴捕获器相连的楔形通道阵列,可以固定及释放包裹于液滴内的单个线虫,并实现对其运动行为和荧光特征的连续监测。本课题组温慧等[61]设计了一种液滴微流控芯片,该芯片可实现单线虫包裹及长期培养,以及通过液滴融合分裂的方式简便地实现液滴内部物质交换,实现了液滴内线虫的长期培养,尤其是从线虫L1期幼虫开始的长期培养。液滴微流控芯片所具有的高通量特性使其成为线虫研究的一个重要平台,但是同时存在着物质交换和精确控制难度大等问题,还需要研究者进一步努力。

3.2 基于微流控芯片技术的线虫应用研究

基于以上微流控线虫操控技术,研究者们在线虫神经生物学、行为、衰老及发育学、药物筛选及基因筛选等领域开展了工作。

3.2.1 神经生物学研究

线虫的神经系统简单,但包含多种神经元,神经递质的合成和代谢过程都与哺乳动物具有高度相似性。此外,由于线虫身体透明,可以通过荧光成像手段直接研究线虫的神经元活性,近来以线虫为模型进行神经生物学研究已经引起越来越广泛的关注。凭借其独特的优势,微流控芯片平台现已应用于对线虫神经生物学的研究中,包括神经元活性[22,25,42,53,62-69]、神经退行性疾病[18,58,59,70]和神经元消融及再生[15,28,71-73]研究。

Chronis等[25]一直在致力于通过钙离子成像对线虫神经元进行追踪,设计的芯片可以固定单个线虫,并对其施加具有不同气味的化学物质,通过钙离子成像观察单个神经元的响应。如图5所示,本课题组的马慧等[20]制作了一个基于微阀的微通道阵列,可以对线虫的多巴胺神经元进行实时成像,对MPP+诱导的线虫运动行为缺陷及其产生机制进行了考察,发现MPP+导致的线虫运动缺陷与其体内多巴胺能神经元的缺失密切相关。

线虫神经元再生研究一般是先通过飞秒激光手术把线虫某神经元烧蚀掉,再观察神经元再生过程,在此过程中需对线虫进行有效固定并精确控制微环境。基于微流控线虫固定技术稳定、易操作、无损伤的特点,微流控芯片可作为较成熟的线虫神经元再生研究平台。Allen等[19]利用神经消融技术对单个突触进行消融,进而观察神经元的变化,发现在发育的神经突触间存在竞争。Adela Ben-Yakar课题组[15]设计了多层微流控芯片用于研究神经再生,在使用飞秒激光纳米轴索显微外科术切断神经元的轴突后,观察了麻醉和非麻醉状态下神经元的再生速度,研究发现神经元以最快2 μm/10 s的速度生长,并且切断的轴突远端片段在无麻醉条件下也会再生长(见图6);在此基础上又开发了新的全自动飞秒激光术以研究线虫中神经元的生长状况[70]。

图 5 芯片上线虫帕金森病模型构建及应用Fig. 5 C. elegans Parkinson’s disease model on a chip a. neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) enabled to induce mobility defects and dopaminergic neurons loss in worms[18]; b. exposure of living worms to 6-hydroxydopamine(6-OHDA) could cause obvious mobility defects, selective degeneration of dopaminergic (DAergic) neurons, and increased oxidative stress in a dose dependent manner[58].

图 6 芯片线虫飞秒激光手术[30]Fig. 6 Process of the automated image processing and laser ablation[30]

3.2.2 行为学研究

线虫的行为取决于多种因素,包括外部刺激和神经元结构等,反映了神经网络中神经元的相互作用。研究线虫行为可作为一种直观且有力的研究手段,为基因功能筛选及药物筛选提供依据和重要信息。由于微流控芯片材料多样化、结构设计灵活、高集成化的特点,可根据研究需要设计多种微环境进行线虫行为考察。目前利用微流控平台进行线虫行为研究主要集中在运动行为[53,54,60,74-78]、趋向性[24,36,39,45,50,53,55-79]和学习行为[50,80,81]方面。

3.2.2.1 运动行为

对线虫运动行为的研究一般通过在芯片上构建微结构模拟线虫的真实生活环境,同时施加刺激,继而研究环境因素对线虫肌肉和运动行为的影响。Sznitman等[74]建立了多种环境下线虫行为分析的模型,微环境包括琼脂板、M9液滴、明胶的M9溶液、充满液体的微培养室、正弦型微通道、微柱阵列、充满M9的丙烯酸塑料表面,根据线虫的运动频率和微环境参数建立了不同环境中的线虫运动模型。

3.2.2.2 趋向性

线虫会对外部施加的刺激产生趋利避害的行为响应,称为趋向性。在微流控芯片上可以对线虫灵活传递精确的化学梯度或电场刺激,而线虫由此所产生的趋化或趋电行为可以得到实时记录。如图7所示,Gray等[79]在2004年设计了一种PDMS-琼脂杂交芯片,研究了线虫对不同氧气浓度的行为响应,发现线虫在5%～12%(v/v)的氧气浓度范围内分布最多。Yang等[45]构将线虫自动分样器和浓度梯度生成器集成到一个微流控芯片上,通过研究线虫在不同化合物作用下对致病菌的行为响应,考察了多种化合物的抗菌作用。

图 7 芯片线虫趋化性研究Fig. 7 Chemotaxis study of worms on a chip a. A gas-phase gradient was established by diffusion along the long axis of the PDMS-Agar device and the preference of worms for 5%-12% oxygen was found[79]; b. An integrated microfluidic platform for evaluating in vivo antimicrobial activity of natural compounds using C. elegans model[45]. CGG: concentration gradient generator.

图 8 芯片上的线虫趋电性研究[36]Fig. 8 Electrotaxis of worms on a chip[36] a. schematic of the device. b. separation of two animals (530 mm long L3 stage and 1000 mm long young adult) within 6 s upon application of 4 V/cm electric field; c. average speed of various animals in a 5 cm long, 300 mm wide and 80 mm deep microchannel.

Rezai等[36]在2010年报道了线虫对电场的行为响应(见图8),他们在直的微通道入口和出口处施加电场,发现线虫的电趋化行为是由神经活性调控的,与线虫的成长期和尺寸有关,并且不同成长期的线虫在某一强度范围的电场内运动速度相同;研究者还发现电场对线虫的生存和繁殖行为没有显著影响。Lockery等[24]在2012年构建了一个连接有电极的微通道阵列,用于记录线虫进食行为对电场的响应,根据加入药物后不同的转基因虫株对电场作用下的进食行为变化筛选出了对某些化合物敏感的转基因虫株。

3.2.2.3 学习行为

线虫是作为一种重要的模式生物,其学习和探索行为与神经传导之间的关系也引起了一些学者的兴趣。Bargmann等[80]设计了一种用于线虫嗅觉行为研究的微流控芯片,在微通道中对线虫头部局部施加有利菌和致病菌,考察线虫对不同细菌的偏好,研究发现线虫具有趋利避害的选择行为。Qin等[81]制作了复杂U形迷宫和T形迷宫,用以研究线虫通过奖励性学习训练后的行为,研究发现线虫在食物等信息的驱动下会有更强的探索和学习能力。Yang等[50]在集成化微流控芯片上,根据不同基因型线虫的趋药性不同对虫株进行了筛选,准确率达91%。这些研究成果说明线虫的行为与环境因素紧密相连,而且受神经调控,但神经回路对线虫学习行为的调控机制还不是很明确。

线虫作为模式生物,其行为研究有着重要的意义,而传统的研究方法由于其局限性无法为线虫构建灵活多变的微环境。微流控芯片的出现为研究线虫的行为提供了良好的平台,这些平台可用于模拟线虫的生活环境,进而研究其学习能力和趋向性。

3.2.3 寿命及发育相关研究

衰老是生物必然要经历的过程,如何延长寿命、提高生命质量是人类永恒的研究课题。线虫由于生命周期短、易于群体培养、与人类基因具有同源性等优点成了研究寿命和发育的良好模型,被广泛用于寿命相关基因评估和药物筛选的研究。近年来,微流控芯片由于其操作简便、通量高等特征也被用来进行线虫寿命及发育研究[8,12,30,46,60,82-85]。

图 9 微流控芯片用于线虫寿命及发育学研究Fig. 9 Microfluidic chip used for worm longevity and development study a. a microfluidic chip for the evaluation of polydatin on C. elegans; b. mechanism of regulation of worm longevity by polydatin[83]; c. time-course images of worm growth within a single droplet for the wild type N2 strain and the hif-1 and vhl-1 mutant worm strain[60].

Hulme等[9]报道了一种集成多个培养室和楔形通道的微流控系统,可完成线虫从L4期开始的长期培养(平均寿命为9天)、线虫运动和体长变化实时监测,为线虫衰老和发育研究提供了一个设计简单、通量高的平台。Xian等[46]设计了一个集成的微流控芯片用于培养线虫,即“Wormfarm”,在其PDMS芯片上有8个独立的培养室,每个培养室可长期培养30～50条同步化的线虫,该芯片允许自动排出线虫的卵并有效控制线虫的环境条件,并且成功地重现了标准的琼脂板实验方法中对线虫进行实验的数据,如在琼脂板上对线虫的RNA干扰调解和饮食诱导对线虫寿命的改变。如图9所示,温慧等[83]建立了两种微流控技术线虫分析平台,并将其用于不同生长期线虫的衰老相关研究,为单线虫水平高通量药物评价提供了重要平台。建立了集线虫进样、长期培养、运动监测、固定及成像多个功能于一体的微流控芯片平台,以线虫为模型开展了天然提取物白藜芦醇苷(PD)对线虫寿命的影响及机制研究,发现PD显著延长线虫寿命并呈现剂量效应关系。此外,PD可促进寿命调控因子DAF-16核转移,增强抗氧化蛋白SOD-3的表达,并可通过抑制衰老相关基因daf-2,上调daf-16表达。结果提示PD延长线虫寿命功效主要与其下调胰岛素(IIS)信号通路有关。该方法操作简单,特别适用于对L4期后单线虫寿命、运动及荧光成像的实时监测,为单线虫水平高通量线虫分析提供了有力平台。温慧等[61]还建立了一种基于液滴微流控芯片的线虫分析新体系,可自动实现对任一生长期的单线虫连续包裹,并且通过简单液滴融合、分裂的方式实现液滴内部物质交换,亦可进行线虫的长期培养。利用上述方法,实现了线虫从L1期到成虫期的培养以及生理活动实时监测,并考察了在线虫体内缺氧诱导因子HIF-1过度表达和表达缺失突变株的发育状况,结果显示HIF-1转录因子过度表达阻滞线虫体长发育、延长生长周期,提示HIF-1可能参与线虫发育调控。该方法适用于对尺寸很小的L1期线虫寿命和运动行为进行高通量分析及应用。

3.2.4 药物筛选和毒性检测

微流控芯片由于其本身的高集成特点,可以在同一芯片上同时实现多种浓度的不同药物筛选。再加上线虫作为模式生物所特有的各种优势,微流控芯片上构建线虫模型用于药物筛选会大大缩短实验时间、节约实验成本、提高筛选效率,因此在药物筛选方面有着广阔的应用前景,目前已有很多研究报道[24,57,58,86-89]。

图 10 液滴微流控芯片用于以线虫为模型的帕金森病药物筛选[58]Fig. 10 Droplet microfluidics for characterizing the neurotoxin-induced responses in individual C. elegans[58] a. schematic and photograph of the droplet-based microfluidic device for individual C. elegans assay; b. performance of the tapered immobilization channel array for immobilizing and imaging of C. elegans; c. DAergic neurons fluorescence images and corresponding stroke frequency of individual UA57 worms treated with different concentrations of 6-hydroxydopamine (6-OHDA); d. oxidative stress fluorescence and corresponding stroke frequency of individual CL2166 worms treated with different concentrations of 6-OHDA.

如图10所示,施维维等[58,59]设计了一系列液滴微流控芯片平台,考察了神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)及其代谢物1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)、6-羟基多巴胺(6-OHDA)对线虫的运动、神经以及氧化应激的影响,结果显示这些神经毒素都会造成线虫的行为缺陷,6-OHDA还会诱导线虫出现多巴胺能神经元变性和氧化应激水平升高等多种响应,且呈现剂量效应;进一步研究发现6-OHDA可能通过提高线虫体内氧化应激水平导致其多巴胺能神经元发生变性,从而使线虫出现运动行为缺陷。这些工作实现了在微流控芯片上构建线虫帕金森病模型,同时可以作为微反应器用于抗帕金森药物的定量评价及筛选。朱国丽等[89,90]在芯片上构建了线虫糖尿病模型,在单线虫水平上探讨了高糖对线虫寿命和氧化应激的影响,同时考察了白藜芦醇苷对高糖引起的线虫寿命及应激响应变化的保护性作用。结果表明,高糖会缩短线虫寿命并增强线虫的氧化应激蛋白GST-4的表达;而白藜芦醇苷会显著减弱高糖诱导的线虫应激反应并延长线虫寿命,表明白藜芦醇苷对高糖诱发的线虫应激反应具有保护性作用。

Lycke等[86]建立了带有实时成像系统的微流控平台,考察了4种杀虫剂(噻嘧啶、左咪唑、三苯双脒、甲氧乙吡啶)对线虫行为的影响,通过定时观察线虫摆动频率、麻痹症状、运动及静止状态的持续时间等指标,发现与其他3种杀虫剂不同的是甲氧乙吡啶作用于nAChR受体,而噻嘧啶与左旋咪唑的效果相似但比左旋咪唑噻更有效,同时三苯双脒更能造成线虫不可逆转的瘫痪;此平台还可与电生理装置联用来快速筛选药物。Zhang等[87]构建了一个包含有进样单元、细胞计数系统、线虫培养室和浓度梯度生成器的微流控芯片平台,研究了重金属锰引起的线虫神经退行性变疾病,发现锰作用下的线虫表现出行动迟缓、氧化应激和多巴胺神经元退行性变,天然抗氧化剂(维生素E、白藜芦醇、槲皮素)可有效治疗这些症状;此平台可完成线虫运动监测和荧光成像,并通过电阻检测完成定数的线虫进样,为毒理评价提供了一个有力平台。

4 结论与展望

综上所述,微流控技术已经在线虫操控方面显示出明显优势,并开始应用于线虫行为研究、神经生物学、寿命及发育研究以及药物筛选等各个领域。特别是其提供可控微环境、精确刺激、灵活的单线虫操控等,这是传统手段无法比拟的。

针对微流控线虫操控技术的特点,在微流控线虫研究方面仍面临很多挑战:1)开发建立针对幼虫期线虫的精确操控新方法,以满足对线虫生长过程中细胞分化、组织器官形成、神经系统发育等实时动态研究的需求;2)根据线虫亚型进行规模筛选,准确选取特定表型的单线虫,并进行后续分析;3)构建线虫疾病模型,探索分子层面的疾病原因和药物作用机理;4)将成熟的微流控线虫操控技术用于深入探讨更加复杂的生物过程和解决人类生命科学领域难题,继续扩大微流控芯片平台在线虫研究方面的应用领域。

随着人们对微流控技术的不断了解和认识以及微流控线虫操控技术的不断发展和成熟,相信基于微流控芯片的线虫研究势必会在生命科学领域发挥越来越重要的作用。

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National Natural Science Foundation of China (No. 81273483).

Advances ofCaenorhabditiselegansresearch on microfluidic device

YIN Fangchao1,2, WEN Hui1, ZHU Guoli1, QIN Jianhua1*

(1. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

The nematodeCaenorhabditiselegans(C.elegans) has been widely used as a multicellular organism for biological research due to its simplicity, short life cycle, and relevance to human genetics and biology. In the past decade, microfluidics technology was emerging as a promising platform for the study ofC.elegansboth in continuous flow-based or droplet-based format. Worm long-term culture, immobilization, sorting, stimuli exposure and individual worm encapsulation have been realized on microfluidic platform. By providing unique capabilities with precise manipulations and controlled microenvironment, this platform has been used for the study of neurobiology, behaviors, aging and development, and drug screening inC.elegans. In this review, we highlight the recent advances of microfluidic technology in worm manipulations and its biomedical applications. The prospects and challenges of microfluidic technology for future studies are discussed as well.

microfluidics;Caenorhabditiselegans(C.elegans); droplets; review

10.3724/SP.J.1123.2016.07017

2016-07-14

国家自然科学基金(81273483).

O658

A

1000-8713(2016)11-1031-12

* 通讯联系人.Tel:(0411)84379059,E-mail:jhqin@dicp.ac.cn.