生物检材中苯巴比妥的测定*

解润芳，张秀峰，李慧方洁，王 蕊

(昆明医科大学法医学院，昆明 650500)



·论 著·

生物检材中苯巴比妥的测定*

解润芳，张秀峰，李慧方洁，王 蕊

(昆明医科大学法医学院，昆明 650500)

目的 建立一种简便、快速、准确、可靠的方法检测生物检材中的苯巴比妥。方法 丙酮∶水(8∶2)对生物检材进行浸泡，然后在pH值为3～4条件下，采用乙酸乙酯进行提取分离，气相-质谱联用(GC-MS)对样品进行检测，使用总离子流图(TIC图)中苯巴比妥保留时间及质谱图中苯巴比妥的特征离子碎片定性，应用外标法进行定量。 结果 该方法简单易操作，背景干扰小，分离效果好，分析速度快，用于苯巴比妥定性的保留时间为8.385 min，苯巴比妥的特征离子碎片为m/z 204和m/z 232；以m/z 204为定量离子碎片，采用外标法进行定量，回收率为87.35%，相对标准偏差RSD为5.43%，最低检出限(LLOD)为0.005 mg/mL。 结论 该方法可用于法医毒物分析生物检材中苯巴比妥的检验，效果良好。

法医毒物分析； 外标法； 气相-质谱联用； 生物检材； 苯巴比妥

苯巴比妥又称鲁米那，在空气中稳定，微溶于水，溶于热水和乙醇，显酸性、易溶于碱性溶液[1-3]。苯巴比妥作为长效巴比妥类药物，具有镇静、催眠、抗惊厥、抗癫痫作用。临床上常用于儿童抗癫痫治疗，随着苯巴比妥的广泛使用，涉及苯巴比妥中毒的案(事)件越来越多，因此建立一种简单、可靠，满足法医毒物分析对生物检材中的苯巴比妥进行检验的方法具有较好的现实意义。现根据苯巴比妥的理化性质及参考文献[4-8]，采用气相-质谱联用(GC-MS)外标法检测生物检材中的苯巴比妥，生物检材经过简单的样品前处理，使用GC-MS对样品进行定性定量分析。报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 GC/MS：Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪；配有电子轰击离子源(EI)及Nest11.0化学图谱库。苯巴比妥标准溶液(1.0 mg/mL)购自司法部司法鉴定科学技术研究所；甲醇(色谱纯)；二次蒸馏水。

1.2 溶液配制 苯巴比妥标准工作溶液：准确移取一定量苯巴比妥标准溶液置于10 mL容量瓶中，应用色谱纯甲醇稀释至刻度，使其浓度为0.01 mg/mL。待测样品：沙某心血、肝脏、胃及胃内容物。

1.3 实验方法

1.3.1 GC/MS仪器条件 离子源：EI源；离子化能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；4极杆温度：150 ℃；色谱柱：HP-5ms 30 m×0.25 mm×0.25 μm。进样口温度：280 ℃；传输线温度：250 ℃；程序升温：初温80 ℃保持3 min，以30 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持8 min；进样方式：分流进样；分流比：10∶1；载气:氦气；纯度：>99.99%；流速：1.0 mL/min。

1.3.2 样品前处理 分别取送检沙某心血5 mL，肝脏10 g(剪碎)，胃及胃内容物10 g(剪碎)，置于50 mL具塞塑料离心管中，均加入20 mL丙酮∶水(8∶2)浸泡约30 min，然后3 000 r/min离心机离心3 min，取出上清液分别放置于3个瓷坩埚中，残渣仍然用20 mL丙酮∶水浸提2次，并把后2次的上清液合并于同一个瓷坩埚中，把瓷坩埚放在85 ℃水浴锅上挥干，取下瓷坩埚，冷却至室温。采用15 mL pH值为3～4的盐酸水溶液少量多次地洗涤瓷坩埚上的挥干物，并转移至50 mL具塞塑料离心管，使用50 mL乙酸乙酯萃取3次，3次萃取液都置于同一瓷坩埚中，把瓷坩埚置85 ℃水浴锅上挥干，取下瓷坩埚，冷却至室温，应用色谱纯甲醇少量多次地洗涤瓷坩埚中的物质，并定容在1 mL色谱纯甲醇中，置于进样瓶中，分别得到沙某待测心血、肝脏、胃及胃内容物。

1.3.3 分析检测 将空白对照样品(色谱纯甲醇)，0.01 mg/mL苯巴比妥标准工作液，沙某待测心血、肝脏、胃及胃内容物，分别进样1 μL，应用GC/MS在1.3.1条件下进行分离分析。

2 结 果

2.1 对照样品结果 空白对照样品在TIC图中8.385 min处未出峰，说明色谱纯甲醇可作为空白试剂使用，不影响测定，可排除假阳性干扰的可能。苯巴比妥标准工作液的TIC图表明，8.385 min出现苯巴比妥的色谱峰，且峰形很好基本呈正态分布，说明所建立的分离分析方法适用于苯巴比妥的检测。苯巴比妥TIC图中色谱峰所对应的质谱图(MS图)显示苯巴比妥的特征离子碎片为m/z 204和m/z 232，与Nest11.0化学图谱库中苯巴比妥的匹配度较高(>95%)，进一步确证为苯巴比妥，且GC/MS分离分析方法还提供苯巴比妥的分子结构，使定性更加准确、可靠。

2.2 待测样品结果 沙某待测心血TIC图中8.385 min未出现苯巴比妥的色谱峰，提示待测心血中未检出苯巴比妥。沙某待测肝脏、胃及胃内容物的TIC图和所对应的MS图表明，8.472 min处出现苯巴比妥的色谱峰，但在8.462 min处出现苯巴比妥的色谱峰，与苯巴比妥标准工作液中苯巴比妥的保留时间(8.385 min)比较,两者均存在微小差异，其中相对误差最大的为1.03%，在定性过程中误差小于3%，不影响定性的准确性。MS图显示待测肝脏、胃及胃内容物均说明苯巴比妥的特征离子碎片为m/z 204和m/z 232，与Nest11.0化学图谱库中苯巴比妥的匹配度较高(>95%)，将成为待测肝脏、胃及胃内容物中检出苯巴比妥的直接依据。见图1。

图1 沙某待测心血的TIC图

2.3 定量结果

2.3.1 定量待测肝脏的制备 准确称取沙某肝脏10.304 50 g(剪碎)，按1.3.2的方法进行样品前处理后，得到沙某定量待测肝脏(CX)；将定量待测肝脏用GC/MS在1.3.1条件下进样1 μL，得到以m/z 204的特征离子碎片为定量离子的峰面积(AX)。将0.01 mg/mL苯巴比妥标准工作液(CS)，用GC/MS在1.3.1条件下进样1 μL，得到以m/z 204的特征离子碎片为定量离子的峰面积(AS)。

2.3.2 肝脏中苯巴比妥含量 按以下2个公式计算沙某肝脏中苯巴比妥含量(WX)，式中V表示定容体积(mL)；W表示称取检材的含量(g)。

(1)

(2)

由公式计算获得肝脏中苯巴比妥含量为0.006 7 mg/g，未超出临床用药的剂量，证实沙某不是死于苯巴比妥中毒。沙某出生3个月后家属发现其出现无诱因抽搐，确诊为癫痫。2015年某日突发抽搐，急送医院救治，入院第2天9:00注射抗癫痫药后出现面色青紫，呼吸不畅，经抢救无效死亡。其生前使用过苯巴比妥，但用量未超出临床用药剂量，因为沙某心血中未检出苯巴比妥，虽肝脏中检出但含量不高，符合临床用药规范；胃及胃内容物中检出，可能是因为死后再分布所引起。

2.4 回收率 采用移液器精确吸取空白全血0.99 mL 4份，分别加入0.01 mL浓度为1 mg/mL的苯巴比妥标准溶液，使空白全血中苯巴比妥的添加浓度均为0.01 mg/mL。再按1.3.2 的方法对4份样品进行处理后，分别进样1 μL，用GC/MS在1.3.1条件进行分离分析，以m/z 204的特征离子碎片作为定量离子碎片，可得到4份样品的峰面积。由公式(1)可计算得到4份样品的实际浓度，从而获得4份样品的平均浓度。因此4份样品的平均浓度除以添加浓度0.01 mg/mL，再乘以100%可计算得出回收率，所建方法的回收率为87.35%。虽然回收率不高，但是所建方法简单，易操作，完全能够满足法医毒物分析快速测定生物检材中苯巴比妥的要求。

2.5 精密度 将0.01 mg/mL苯巴比妥标准工作液，用GC/MS在1.3.1条件下，连续进样5次，每次进样1 μL，可得到5次进样m/z 204的特征离子碎片的峰面积，由此可计算精密度，所建方法的相对标准偏差(RSD)为5.43%，RSD小于10%说明所建方法的精密度良好，能满足实际工作的检测需要。

2.6 稳定性 按2.4方法配制的空白血添加样品，分别在样品处理前、后室温放置1、3、6、12、24 h后，采用1.3.2 方法进行样品处理，用GC/MS在1.3.1色谱条件下进样进行测定，分析结果相对误差均小于10%。结果显示，所建方法稳定性良好。

2.7 最低检测限(LLOD) 分别将0.01 mg/mL苯巴比妥标准工作液，用色谱纯甲醇梯度稀释配制成苯巴比妥含量为0.005、0.001 mg/mL的标准工作液。用GC/MS在1.3.1色谱条件下进行测定。苯巴比妥含量为0.005 mg/mL的标准工作液S/N>3，苯巴比妥含量为0.001 mg/mL的标准工作液S/N<3，因此，所建方法的最低检出限为0.005 mg/mL，说明所建方法灵敏度良好。

3 讨 论

采用GC-MS测定生物检材中的苯巴比妥是一种简便、快速、准确、可靠的方法，具有许多优点。方法简单、易操作、生物样品仅经过简单的样品前处理，检测结果显示基质干扰小，分离效果好，特别适用于临床及司法鉴定中快速测定的要求。所建方法以总离子流图苯巴比妥的保留时间初步定性，并将质谱图与Nest11.0化学图谱库比较进行确证，用单点外标法进行定量分析，方法定性定量准确。所建方法经过方法学验证，分离度、回收率、RSD、LLOD等指标都符合测定要求。

[1]张杰．浅谈红外光谱法定性分析苯巴比妥的一点体会[J]．中国医药指南，2013，11(36)：374-374．

[2]王勇，黄竹芳，贠克明，等．生物检材中苯巴比妥气相色谱和气相色谱/质谱检测[J]．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7(5)：567-568．

[3]刘光斌，姜芳宁，高颖．高效液相色谱外标法快速测定苯巴比妥血药浓度[J]．中国医院用药评价与分析，2012，12(9)：811-813．

[4]余勤，梁茂植，向瑾，等．EMIT法和HPLC法监测苯妥英和苯巴比妥血药浓度比较研究[J]．检验医学，2007，22(4)：455-458．

[5]蔡明招，金永春，吴惠勤，等．GC/MS同时检测人体液中8种酰胺结构的精神类药物[J]．分析试验室，2007，26(9)：46-50．

[6]袁烨，郭巍巍，李军，等．GC-MS法同时检测人尿液中10种常见安眠药物[J]．中国药房，2013，24(46)：4362-4363．

[7]朱鹏飞，刘文卫，周闰，等．HPLC-MS/MS同时检测人尿中巴比妥,苯巴比妥,异戊巴比妥,司可巴比妥[J]．中国卫生检验杂志，2012，29(9)：2003-2006．

[8]施介华，彭丽．胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比妥、艾司唑仑和氯硝西泮[J]．色谱，2010，28(10)：959-964．

Determination of phenobarbital in biomaterial*

XIERunfang,ZHANGXiufeng,LIHuifangjie,WANGRui

(SchoolofForensicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500，China)

Objective To establish a kind of simple,rapid,accurate and reliable method to determine the phenobarbital in the biomaterial.Methods We pre-treated biomaterial by the method that the reagent of acetone∶water (v/v 8∶2) was firstly used to soak the biomaterial,and then we took use of ethyl acetate as reagent to extract the phenobarbital of the biomaterial in the present of pH=3-4.We finally employed GC-MS to determine these samples.On the one hand,we not only took advantage of the retention time of the phenobarbital in total ion current (TIC) but also took advantage of the characteristic fragment ions of phenobarbital in mass spectrogram as qualitative basis.On the other hand,we took advantage of the external standard method as quantitative basis.Results The method had the characteristics of the simple and easy operation.There was hardly background interference and there was good separation effect in the method.The method also had the characteristics of fast analytical speed such as the retention time of the phenobarbital was 8.385 min.The characteristic fragment ions of phenobarbital was m/z 204 and m/z 232.The characteristic fragment ions of m/z 204 was served as quantitative ion fragments and we employed the external standard method to quantify in the method.In short,the average recovery rate of the method was 87.35%.Relative standard deviation (RSD) was 5.43% in the method.The lowest limit of detection (LLOD) was 0.005 mg/mL.Conclusion The method showes satisfactory result that it could be applied to determine the phenobarbital of the biomaterial of forensic toxicological analysis.

forensic toxicology analysis; the external standard method; GC-MS; biomaterial; phenobarbital

云南省科技厅/昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目(2014FB013;2016FZ007)。

解润芳，女，讲师，主要从事毒药物分析研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.004

A

1673-4130(2016)20-2813-03

2016-04-16

2016-07-28)