卢立康唑醇质体透皮性实验研究

樊建峰，林碧雯，李恒进（解放军总医院皮肤科，北京 100853）

卢立康唑醇质体透皮性实验研究

樊建峰，林碧雯，李恒进（解放军总医院皮肤科，北京 100853）

目的：探讨卢立康唑醇质体的透皮性，为其新制剂开发提供理论参考。方法：通过检测卢立康唑醇质体、脂质体、软膏、45%水醇溶液经大鼠皮肤的48 h药物渗透累积量、药物滞留量及透皮速率，比较不同制剂的透皮性差异。结果:卢立康唑24 h单位面积累积透皮量醇质体优于其他剂型（P ＜ 0.05），卢立康唑48 h单位面积累积透皮量：醇质体/软膏＞脂质体/45%水醇溶液（P ＞ 0.05）。透皮速率大小顺序为：醇质体＞软膏＞ 45%水醇溶液＞脂质体（P ＜ 0.05)。卢立康唑药物滞留量顺序为：醇质体/软膏＞脂质体＞ 45%水醇溶液（P ＜ 0.05），但醇质体与软膏在全层皮肤中滞留量差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。结论：卢立康唑醇质体透皮性优于脂质体、软膏、45%水醇溶液，有良好的体外透皮性，可作为药物载体。

卢立康唑醇质体；透皮性；渗透累积量；药物滞留量；透皮速率

卢立康唑（luliconazole）是日本Nihon Nohyaku公司于2005年研制的一种咪唑类抗真菌药物。该药主要通过阻断麦角固醇的生物合成，发挥抗真菌作用。大量实验研究结果表明，卢立康唑在体外抗菌活性、真菌动物模型及临床实验中均显示了广谱强效的抗菌作用，目前国外有外用脂质体制剂用于临床，但尚无醇质体制剂的研究及临床应用。由于醇质体制剂较脂质体制剂有更好的透皮性，笔者通过研究卢立康唑醇质体经大鼠皮肤的药物渗透累积量、药物滞留量及透皮速率三项指标，比较卢立康唑醇质体与软膏、脂质体及水醇溶液之间透皮性的差别，初步考察醇质体作为药物载体的透皮性能的优缺点，为卢立康唑新制剂的开发提供理论参考。

1　实验材料

1.1实验动物

SD大鼠24只，SPF级，雄性，二级动物，体质量250 ～ 300 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-（军）2012-0004。

1.2实验仪器与药品

探头式超声破碎乳化仪（美国Fisher Scientific公司）；德国Sigma 3-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；RYJ-12B 型Franz扩散池（上海黄海药检仪器有限公司）。

卢立康唑醇质体、脂质体、45%乙醇水溶液（自制），卢立康唑软膏（海南海灵化学制药有限公司）。

2　方法

2.1药物含量的测定

采用HPLC法分别测量卢立康唑醇质体样品、脂质体样品、水醇溶液样品中的卢立康唑药品含量。

2.2离体鼠皮的制备

取体质量为250 ～ 300 g，正常SD大鼠24只，实验前24 h用8%硫化钠进行腹部脱毛，并用0.9%氯化钠注射液洗净，饲养。

用手术刀剥离腹部皮肤，分离皮下组织和脂肪，剃毛器再次剔除毛发，选用无破损皮肤浸泡于0.9%氯化钠注射液中，放置于4 ℃冰箱中保存备用，24 h内使用。实验前仔细检查鼠皮的完整性。

2.3体外大鼠皮肤透皮实验及渗透累积量测定

取预先制备好的离体鼠皮，将皮肤水平架放好，角质层向供给池，皮下组织向接收池。接收池加满接收液，排空气泡，平衡30 min。

更换接收液。供给池加不同制剂处方的卢立康唑（药品含量固定1 mg），其含量足够维持稳态，并使角质层面完好接触给药制剂。用封口膜覆盖密封供给池，用小磁粒不断搅拌接收液以确保药物均匀分散。拟在0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h测定药物透皮量。实验时间为48 h。

每个时间点从接收池取出1 mL，同时取出同体积新鲜接收液补回且进行稀释校正，采用HPLC法测定药物峰面积，代入标准曲线求出药物浓度，计算累积渗透量和透皮速率。根据每个取样点样品的浓度，计算单位面积累积渗透量Q，见公式：

将整套扩散池装置放在恒温磁力搅拌器上，磁力搅拌速度350 r·min-1，温度保持在37 ℃。

2.448 h药物滞留量测定

48 h后，取下皮肤，用水洗净，滤纸使其干燥。去除角质层：透明胶带反复黏贴鼠皮表面20次，将胶带浸入20 mL甲醇中，提取药物24 h，再超声提取3次，每次15 min，0.45 μm的微孔滤膜过滤后采用HPLC法对药物含量进行测定。此为角质层中卢立康唑药物滞留量。每个制剂采用6个不同透皮实验，结果用（）表示。

2.5统计学分析

3　结果

3.1渗透累积量

结果表明，卢立康唑24 h单位面积累积透皮量醇质体优于其他剂型（P ＜ 0.05），48 h单位面积累积透皮量：醇质体/软膏＞脂质体/45%水醇溶液（P ＞0.05）。详见表1。

表1　卢立康唑各制剂48 h总渗透累积量. mg·mL-1，n = 6，Tab 1　The cumulative transdermal amount of luliconazole with different dosages for 48 h.mg·mL-1,n = 6,

表1　卢立康唑各制剂48 h总渗透累积量. mg·mL-1，n = 6，Tab 1　The cumulative transdermal amount of luliconazole with different dosages for 48 h.mg·mL-1,n = 6,

时间/h　醇质体　脂质体　软膏　45%水醇溶液0.5　0.004 5±0.003 1　0.006 7±0.010 2　0.000 6±0.001 1　0.010 7±0.018 8 1 0.005 6±0.006 3　0.007 4±0.012 4　0.003 4±0.006 4　0.019 7±0.032 8 2 0.025 9±0.015 8　0.010 9±0.023 3　0.009 9±0.014 1　0.034 8±0.050 8 3 0.046 3±0.027 3　0.019 5±0.042 8　0.018 4±0.021 6　0.054 7±0.066 6 4 0.072 4±0.035 7　0.038 1±0.038 3　0.029 5±0.030 1　0.067 6±0.070 1 6 0.129 4±0.052 3　0.080 8±0.143 4　0.053 1±0.053 0　0.098 5±0.087 7 8 0.169 9±0.049 8　0.088 1±0.127 7　0.080 4±0.068 7　0.124 1±0.094 0 12　0.268 6±0.077 1　0.126 4±0.200 1　0.145 8±0.123 8　0.170 2±0.107 0 24　0.508 9±0.032 5　0.291 6±0.201 7　0.333 0±0.193 5　0.309 5±0.122 2 48　0.661 8±0.041 9　0.511 5±0.195 7　0.571 9±0.206 2　0.449 8±0.085 7

3.2渗透速率

透皮速率大小顺序为：醇质体＞软膏＞ 45%水醇溶液＞脂质体，卢立康唑醇质体的稳态流速为（7.625 3±0.465 0） μg·cm-2·h-1，与软膏、脂质体和乙醇水溶液3种制剂相比，醇质体的透皮速率分别提高了1.57、1.81和1.63倍。表明卢立康唑醇质体在渗透性能方面显著优于传统脂质体、水醇溶液及软膏（P ＜0.05）。结果见图1，渗透速率J = Q/Δt （Δt为取样点的时间间隔）。

3.348 h药物滞留量

结果表明：透皮研究48 h后，卢立康唑各剂型在全层皮肤中测得卢立康唑滞留量顺序为：醇质体/软膏＞脂质体＞体积分数45%乙醇溶液（P ＜ 0.05），但醇质体与软膏在全层皮肤中滞留量并无显著性差异（P ＞0.05）。48 h后卢立康唑醇质体、脂质体与软膏在角质层中滞留量无统计学差异（P ＞ 0.05），醇质体及软膏制剂较水醇溶液在角质层滞留量大，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；脂质体与水醇溶液在角质层滞留量差异无统计学差异（P ＞ 0.05）。详见表2。

图1　卢立康唑不同剂型24 h透皮拟合曲线A – 醇质体，B – 软膏，C – 脂质体，D – 45%水醇溶液Fig 1　The transdermal fitting curve of luliconazole with different dosages in 24 hA – ethosome,B – ointment,C – lipidosome,D – 45% hydroalcoholic solution

4　讨论

浅部真菌感染是发病率较高的一种皮肤病，部分患者难以治愈，尤其是足癣。因为大部分外用抗真菌药物都需要2 ～ 4周的治疗时间。由于皮肤角质层屏障的存在，一般经皮外用药物难以携带大量药物进入皮肤深层，抗菌效果欠佳。卢立康唑是一种新型的咪唑类抗真菌药物[1]，有较强的抗真菌作用，疗程短，目前国外有脂质体制剂上市。

醇质体作为囊泡型载体，可增加药物的经皮渗透性，延缓药物的释放，其主要有2个方式发挥促渗机制[2]：①穿透机制：完整的醇质体囊泡作为药物载体，因自身含有类细胞膜的特殊结构，其能带着药物进入角质层，甚至可达到皮肤深层。醇质体的特点就在于醇质体磷脂层中高浓度的醇（乙醇、异丙醇等）可增强膜的柔韧性和流动性，使其在传递过程中发生变形，更易通过比其更小的间隙，透过紊乱的角质层，增强渗透，加速渗透，使药物更快、更充足的到达靶部位发挥作用。②融合机制：醇质体囊泡作为渗透增强剂，其磷脂与角质层的细胞间脂质融合，增加药物在角质层的溶解度，使得药物分子本身透入皮肤[3]。在醇质体透皮过程中，因其可使角质层脂质双层中疏水性尾部排列紊乱，组成和结构发生改变，降低脂质的临界温度，增加角质层表皮脂质的流动性，同时高浓度乙醇可增强膜的渗透性，使包封在醇质体中的药物通过扩散和毛细吸力作用，进入深层皮肤的细胞间隙，或透过细胞膜将药物直接释放到细胞内发挥作用[3-4]。

在评价经皮制剂时，稳态透皮速率和皮肤滞留药量是2个重要评价指标[5]。国内学者[6]进行秋水仙碱醇质体体外透皮实验，结果表明醇质体稳态透皮速率分别是30%乙醇溶液的1.24倍，脂质体的4.80倍，水饱和溶液的5.87倍。可见醇质体更易携带药物更快速渗透达到靶组织，使药物起效迅速，从而彻底发挥作用。同时，很多相关实验表明[7-8]，醇质体作为透皮载体，可增加药物的透皮量和穿透深度。皮肤滞留量是通过测定透皮实验后皮肤中残留的药物量来计算的，是评价药物渗透性及局部药效的重要指标。饶跃峰等[7]研制的非那甾胺醇质体作用于人体皮肤，24 h后药物滞留量次序为：醇质体＞ 30%乙醇溶液＞脂质体＞水饱和液，在真皮组织中，醇质体的药物滞留量明显大于其他样品组，为脂质体的2.5倍。0.1%（w/v）雷公藤甲素的各种制剂24 h透皮累积量结果显示：雷公藤甲素醇质体达83.7%、空白醇质体/雷公藤甲素水醇溶液为59.4%、水醇溶液为36.8%。可见醇质体不仅可提高药物透皮速率，也可提高药物在皮肤局部的滞留量。于燕燕等[9]发现鬼臼毒素醇质体12 h较其他剂型有较大的皮肤滞留量。

表2　不同剂型的卢立康唑在皮肤中的药物滞留量. mg·mL-1Tab 2　The retention amount of luliconazole with different dosages for 48 h.mg·mL-1

抗真菌药物研究方面，盐酸阿莫罗芬醇质体经共聚焦激光扫描显微镜实验表明，醇质体与脂质体及乙醇溶液相比，可更有效增加药物的透皮量和穿透深度，增加药物在皮肤中的滞留量[10]。刘利萍等[11]制备的克霉唑醇质体组杀菌所需克霉唑剂量明显低于脂质体组。另外，在杀菌起效方面，克霉唑醇质体明显优于脂质体和乙醇水溶液。最低抑菌浓度、最低杀菌浓度和抗菌-时效实验结果也证明了醇质体比脂质体具有更快的透过速率、更高的渗透能力和更短的时滞，从而使药物能够更快、更好地发挥抗菌作用，有助于深层真菌感染的治疗。

本研究结果表明，卢立康唑醇质体经皮渗透的速率明显优于软膏、脂质体和水醇溶液剂型。卢立康唑各剂型24 h单位面积累积透皮量醇质体优于其他各剂型，48 h药物透皮量醇质体与软膏相当，优于脂质体及水醇溶液；在全层皮肤药物滞留量上醇质体与软膏制剂相当，并优于脂质体及水醇溶液。综上，卢立康唑醇质体具有优良的体外透皮性，可作为药物载体，为其新剂型的研发提供理论参考。

[1] 刘永贵，田红，沈雪砚，等.新型外用抗真菌药卢立康唑[J].药物评价研究，2014，37（6）：577-580.

[2] Touitou E,Dayan N,Bergelson L,et al. Ethosomes-novel vesicular carriers for enhanced delivery: characterization and skin penetration properties[J]. J Control Release,2000,65(3): 403-418.

[3] Touitou E,Godin B,Dayan N,et al. Intracellular delivery mediated by an ethosomal carrier[J]. Biomaterials,2001,22(22): 3053-3059.

[4] 吕立华，吕林华，张玉碧.正交试验设计优化银杏内酯B醇质体的制备工艺[J].齐齐哈尔医学院学报，2012，33（16）：2213-2214.

[5] 李理宇，王洪权.新型经皮给药载体—醇质体的研究进展[J].中国新药杂志，2010，19（1）：33-38.

[6] 杨飞，李芳，焦海胜，等.秋水仙碱醇质体的制备及体外经皮渗透研究[J].中国药学杂志，2009，44（5）：349-352.

[7] 饶跃峰，张幸国，赵青威，等.非那甾胺醇质体和脂质体的经皮渗透比较研究[J].中国药学杂志，2007，42（23）：1790-1793.

[8] 林碧雯，王文娟，王洪权，等.新型药物载体—醇质体的特点及研究进展[J].中国药物应用与监测，2014，11（2）：121-124.

[9] 于燕燕，赵继会，冯年平，等.鬼臼毒素醇质体的体外经皮渗透特性研究[J].中草药，2012，43（1）：74-77.

[10] 王慧，魏玉辉，刘文静，等.盐酸阿莫罗芬乙醇脂质体的制备及评价[J].中国新药杂志，2010，19（13）：1175-1179.

[11] 刘利萍，毛威，安原初.克霉唑醇质体和脂质体的体外经皮渗透性及抗菌性的对比研究[J].中国药学杂志，2009，44（4）：278-282.

Study on the in vitro transdermal experiment of luliconazole ethosomes

FAN Jian-feng,LIN Bi-wen,LI Heng-jin(Department of Dermatology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective: To investigate the transdermal difference of luliconazole ethosomes,and provide references for the development of new dosages. Methods: 48 h cumulative transdermal amount,retention of the drug and permeation rate were analyzed about luliconazole ethosomes,lipidosome,ointment and 45% hydroalcoholic solution. Results: The cumulative transdermal amount of luliconazole ethosomes at 24 h was superior to others (P ＜ 0.05). The transdermal amount of luliconazole at 48 h were as follows: ethosomes/ointment ＞ lipidosome/45% hydroalcoholic solution (P ＞ 0.05). The permeation rate of luliconazole were as follows: ethosomes ＞ ointment ＞ 45% hydroalcoholic solution ＞ lipidosome (P ＜ 0.05). The retention of luliconazole were as follows: ethosomes/ointment ＞ lipidosome ＞ 45% hydroalcoholic solution (P ＜ 0.05),while the retention in full-thickness skin showed no significant difference between luliconazole ethosomes and ointment (P ＞ 0.05). Conclusion: The transdermal ability of luliconazole ethosomes is better than lipidosome,ointment and hydroalcoholic solution,which could be used as drug carrier.

Luliconazole ethosomes; Transdermal ability; Cumulative transdermal amount; Retention of drug; Penetration rate

R94

A

1672 - 8157(2016)01 - 0017 - 04

军队十二五面上项目（CWS11J114）

李恒进，男，主任医师，主要从事皮肤病理工作。E-mail：lhengjin@163.com

樊建峰，男，副主任医师，主要从事皮肤真菌病及银屑病治疗。E-mail：fanjianfeng1@tom.com

（2015-08-31

2015-11-15）