福林试剂法快速检测藤仓赤霉发酵液中赤霉酸含量

周圣骄， 宋志远， 聂志奎*

(1.江西新瑞丰生化有限公司，江西新干 331300；2.江西省植物生长调节剂工程研究中心，江西新干 331300)



福林试剂法快速检测藤仓赤霉发酵液中赤霉酸含量

周圣骄1,2， 宋志远1， 聂志奎1,2*

(1.江西新瑞丰生化有限公司，江西新干 331300；2.江西省植物生长调节剂工程研究中心，江西新干 331300)

[目的]优化福林试剂法的反应条件。[方法]以从紫外诱变样品中筛选获得的1株高产藤仓赤霉菌(G.fujikuroi) F12为研究对象，采用福林试剂法，通过溶液吸光值的变化定量检测藤仓赤霉菌发酵液中赤霉酸(GA3)的产量。[结果]当福林试剂的用量为1.5 mL、盐酸用量为3.0 mL、加热时间为20 min时，所得溶液吸光值稳定性最好，在4 h以内基本保持不变。[结论]福林试剂法操作简便、检测快速准确，可用于藤仓赤霉菌发酵液中GA3的快速检测。

赤霉酸;福林试剂;快速检测法;藤仓赤霉菌;吸光值

赤霉酸(GA3)属于生物体内的一类四环二萜类化合物，是一种天然的植物生长调节剂，与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯共称为植物的五大内源激素[1-2]。由于GA3在植物生长周期全过程中可促进与调节各种发育过程，如种子萌发、茎的伸长、性别表达和果实形成等[3-6]，它被广泛应用于农业、林业、酿造业等各个行业，具有很大的经济效益和市场前景。

GA3的化学结构复杂，虽然利用化学合成法也能生产GA3，但是存在步骤繁琐、副产物多、分离困难等问题，导致GA3价格非常高[7]。目前，GA3的工业化生产还是依赖于高产藤仓赤霉菌(G.fujikuroi)作为发酵菌种的液体深层发酵法[8]。但GA3的工业化发酵产量较低，导致GA3一直无法进行大规模应用。为了进一步提高GA3产量，大量的研究工作都围绕着赤霉菌的诱变和筛选进行。但是诱变筛菌操作繁琐，诱变得到的菌株数量非常多，如果仅仅依靠液相色谱法进行含量测定，每天只能测定70多个菌，工作量极大[9-10]。目前，关于福林试剂法快速检测GA3含量的研究已有报道[11-13]，而且效果较好，可以对赤霉菌发酵液中的GA3进行较精确的测量。该方法比较简单，在酶标仪的操作下1 d可对上千个样品进行快速测定，从而节省大量时间。由于福林试剂与浓盐酸的用量以及加热时间不仅影响反应后的吸光值，同时还影响吸光值的稳定性，笔者采用福林试剂法快速检测藤仓赤霉菌发酵液中GA3含量，对该方法进行了进一步优化，旨在为突变菌株的大规模筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株。藤仓赤霉菌F12，为江西新瑞丰生化有限公司实验室紫外诱变筛选获得。

1.1.2 试剂。GA3标准品、福林试剂、无水乙醇(分析纯)、37%浓盐酸均购自Sigma试剂公司。

1.1.3 培养基。种子培养基：30.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁,pH自然,115 ℃下灭菌30 min。发酵培养基：60.00 g/L葡萄糖，5.50 g/L酵母粉，0.20 g/L磷酸二氢钾，0.20 g/L硫酸镁，100 μL微量元素(0.10 g/L CaCl2，0.10 g/L FeCl3, 0.05 g/L MnCl2)，pH自然，115 ℃下灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 发酵样品处理。取3.0 mL发酵后菌液，先用滤纸过滤得到较澄清的滤液，然后用0.22 μm滤头对滤液进行过膜处理，得到澄清样品，再进行高效液相色谱(HPLC)分析。

1.2.2 HPLC测定GA3含量。标准C18液相色谱柱250.0 mm×4.6 mm；紫外检测波长210 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相为100%甲醇与0.05%磷酸；柱温28 ℃。

1.2.3 标准曲线的建立。将GA3标准品溶解于色谱纯乙醇，配制成0.20 g/L的标准液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的标准液于玻璃试管中，蒸发乙醇溶剂，再加入1.5 mL福林试剂与3.0 mL盐酸，沸水浴反应20 min，冷却，定容至10.0 mL，680 nm波长处比色。

1.2.4 赤霉素发酵液的测定。过膜样品稀释一定倍数后，取2.0 mL置于玻璃试管中，滴入0.5 mol的盐酸调节pH为1～2，再加入2.0 mL乙酸乙酯，充分振荡后静置分层，取上层乙酸乙酯萃取液0.5 mL，加入试管中，先蒸去溶剂，再加入1.5 mL福林试剂与3.0 mL浓盐酸，沸水浴20 min，冷却，定容至10.0 mL，680 nm波长处比色，根据标准曲线查出相应GA3微克数(G)。

1.2.5 发酵液GA3含量测定计算方法。

式中,0.88表示水、乙酸乙酯比例为1∶2时乙酸乙酯对赤霉素的抽提率。

1.2.6 不同批次的GA3发酵液福林试剂法与HPLC检测比对分析。对不同批次的GA3发酵液进行处理后, 分别采用福林试剂法和HPLC检测，对2种检测方法进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 福林试剂用量对吸光值的影响 取0.5mLGA3标准品，分别加入3.0mL浓盐酸与不同量福林试剂，反应后测量吸光值。由表1可知，溶液反应后，吸光值随着福林试剂用量的增大先变大后变小，颜色先加深后变浅，推测原因是福林试剂把GA3降解物反应完全后，剩余的福林试剂稀释了反应溶液，从而导致吸光值的降低、颜色的变浅。当福林试剂的添加量为1.5mL时吸光值最大，因此，福林试剂的用量选择1.5mL。

表1 福林试剂用量对吸光值的影响

Table1EffectofamountofFolin-Ciocalteu’sphenolreagentonabsorbance

福林试剂用量DosageofFolin⁃Ciocalteu’sphenolreagent∥mL吸光值Absorbance颜色变化Changeincolor1．00．7832黄色转为浅绿色1．50．9423黄色转为墨绿色2．00．8777黄色转为墨绿色2．50．7458黄色转为浅绿色3．00．7251黄色转为浅绿色3．50．6905黄色转为浅绿色

2.2 盐酸用量对吸光值的影响 取0.5 mL GA3标准品，分别加入不同量浓盐酸与1.5 mL福林试剂，反应后测量吸光值。由表2可知，随着浓盐酸加入量的增大，吸光值先增加后不变，颜色变化由浅到深。推测原因是盐酸的量比较少时未和GA3完全反应，随着浓盐酸用量的增大，GA3逐渐被降解，吸光值逐渐增大，当GA3全部被盐酸降解后吸光值基本保持不变。当浓盐酸用量增加到3.0 mL左右，吸光值变化非常缓慢，所以浓盐酸的用量选择3.0 mL。

表2 盐酸用量对吸光值的影响

2.3 加热时间对吸光值的影响 0.4 mL GA3标准样品加入1.5 mL福林试剂和3.0 mL浓盐酸后，必须经过沸水浴才能使反应完全进行，因此，确定最佳的反应时间对体系的稳定性非常重要。由图1可知，吸光值随着加热时间的延长先变大后保持不变，推测原因，溶液反应是在20 min时才基本结束，此时吸光值保持不变，所以选择加热时间为20 min。

图1 加热时间对吸光值的影响Fig.1 Effect of heating time on absorbance

2.4 稳定性验证 确定了最佳盐酸与福林试剂的添加量以及加热时间后，对溶液的吸光值的稳定性进行考察。0.4与0.6 mL标准品经过显色反应后，在室温下放置，每隔一段时间测量吸光值，发现当取1.5 mL福林试剂与3.0 mL浓盐酸时，溶液的稳定性在4 h以内较好，吸光值基本保持不变(表3)。

表3 稳定性测试结果

2.5 标准曲线 由图2可知,当GA3质量在40～240 μg时,

图2 GA3标准曲线Fig.2 The standard curve of GA3

吸光值基本上呈线性关系，在该浓度范围内得到吸光值与GA3的线性方程为：y=0.003 23x+0.550 22,R=0.990 1。

2.6 福林试剂法与HPLC检测结果比较 由表4可知，福林试剂法与HPLC测试结果比较相似，说明福林试剂法可用于发酵液中GA3的检测。

表4 福林试剂法与HPLC测试结果比较

Table 4 The comparison of determination results by Folin-ciocalteu′s phenol reagent method and HPLC

样品SamplesGA3含量GA3content∥mol/L福林试剂法Folin⁃ciocalteu′sphenolreagentmethod液相色谱法HPLC14203982443415347345444984895556521

3 结论

通过对福林试剂法快速检测藤仓赤霉菌发酵液中GA3进行探讨，优化了影响吸光值的3个因素，提高了系统的稳定性，并在此基础上对福林试剂法和HPLC进行了对比分析，从实践上验证了福林试剂法检测GA3的可行性。与HPLC相比，福林试剂法操作简单、检测快速准确，大大降低了筛菌过程的工作量，对赤霉菌诱变育种工作中高产菌株的快速检测以及GA3发酵过程的简易监测有重要作用。

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Quick Detection of Gibberellins in Gibberella fujikuroi Fermentation Broth Using Folin-Ciocalteu’s Phenol Reagent

ZHOU Sheng-jiao1,2, SONG Zhi-yuan1, NIE Zhi-kui1,2*

(1. Jiangxi New Reyphon Biochemical Co. Ltd., Xingan, Jiangxi 331300; 2. Jiangxi Plant Growth Regulator Engineering Research Center, Xingan, Jiangxi 331300)

[Objective] The aim was to optimize reaction conditions of Folin-Ciocalteu’s phenol reagent. [Method] With high-yieldGibberellafujikuroiF12 as the research strain which was isolated from large quantities of UV mutation samples, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent method was used to quickly detect the gibberellin acid (GA3) yield inGibberellafujikuroifermentation broth by the change of absorbance. [Result] When 1.5 mL Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, 3.0 mL hydrochloric acid as well as 20 min heating time was selected, the final solution absorbance had the best stability and still remained basically unchanged within 4 h. [Conclusion] The optimized method can quickly and accurately detect the GA3yield inGibberellafujikuroifermentation broth.

GA3; Folin’s reagent; Quick detection;Gibberellafujikuroi; Absorbance

周圣骄(1979- )，男，湖北京山人，工程师，从事微生物代谢工程研究。*通讯作者，工程师，博士，从事微生物代谢工程研究。

2016-08-10

S 13

A

0517-6611(2016)28-0017-02