未名玫瑰葡萄秋水仙素诱导与鉴定

闫爱玲， 王慧玲，孙 磊，张国军，王晓玥，徐海英*

(1.北京市农林科学院林业果树研究所,北京100093；2.北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093；3.农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,北京 100093)



未名玫瑰葡萄秋水仙素诱导与鉴定

闫爱玲1，2， 王慧玲1，3，孙 磊1，2，张国军1，王晓玥1，徐海英1*

(1.北京市农林科学院林业果树研究所,北京100093；2.北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093；3.农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,北京 100093)

[目的]研究未名玫瑰葡萄秋水仙素处理的最适浓度和时间，及适宜的倍性鉴定方法。[方法]以秋水仙素为诱变剂，利用不同浓度的秋水仙素浸泡种子不同时间，对二倍体葡萄未名玫瑰品种进行加倍诱导，并采用流式分析仪对诱变植株的细胞 DNA 含量进行鉴定。[结果]从诱导成活率和四倍体诱变率综合考虑，诱变四倍体未名玫瑰种子的适宜条件：当种子胚根长1.0 cm时，用0.5%秋水仙素处理96 h，其成活率和四倍体率分别为11.33%和5.12%。[结论]用倍性分析仪测定细胞倍性是一条简便快捷的鉴定方法。处理时间是影响成活率、四倍体率和变异率的主要因素。

葡萄；秋水仙素；四倍体；倍性分析

多倍体植物具有生物产量高、器官巨大性、抗病抗逆能力强等特性。多倍体葡萄的叶片、果粒性等比二倍体葡萄更大，抗逆能力更强，在生产上得到大面积的推广(如巨峰葡萄)。但四倍体葡萄品种单一(主要为巨峰系及后代等欧美品种[1-2])，无法满足市场需求。因此,对二倍体鲜食葡萄品种或育种亲本进行染色体加倍，经筛选获得四倍体品种，可获得直接用于生产的四倍体品种，另一方面能获得四倍体新种质，为进一步育种奠定基础。

Dermen[3]在夏葡萄(Vitisaestivalis)、欧洲葡萄(V.vinifera)和圆叶葡萄(V.rotundifolia)上获得了四倍体或嵌合体。我国许多育种工作者均采用秋水仙素处理二倍体葡萄品种的生长点等获得四倍体葡萄[4]。马爱红等[2]、张淑爱等[5]和卢炳芝等[6]利用组织培养的方法，用秋水仙素处理葡萄试管苗茎段和胚状体，也获得四倍体。但该方法获得四倍体品种还需要经过组培苗的培养、移栽、炼苗等过程，较麻烦。在有足够种子的条件下，陈俊等[7]通过诱导葡萄种子，获得的四倍体直接从种子发芽生长成苗。笔者以秋水仙素为诱变剂，利用不同浓度的秋水仙素浸泡种子不同时间，对二倍体葡萄未名玫瑰品种进行加倍诱导，并采用流式分析仪对诱变植株的细胞DNA含量进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 取二倍体葡萄品种未名玫瑰的种子，先将种子进行催芽，待胚根长0.5～1.0 cm时进行处理。

1.2 方法

1.2.1 种子浸泡法。将胚根长0.5～1.0 cm的种子浸泡在不同浓度秋水仙素培养皿中，上面盖一薄层脱脂棉，盖上培养皿，放置于室温(25±2)℃的培养间内培养48～96 h。处理后统计各处理成活种子数；播种至营养钵内，温室发芽成苗。将成活的幼苗移入大田，待长出几片新叶后，将植株的幼嫩叶片取回，进行DNA检测。秋水仙素浓度分别为0.4%、0.5%、0.6%，处理时间分别为48、72、96 h，共9个处理。

1.2.2 植株倍性鉴定。采用倍性分析仪进行细胞倍性鉴定。将10 mg新生幼嫩叶片在0.5 mL Pratec HR-A溶液中研磨。将样品通过30 μmol Pratec Celltrics微孔膜过滤到测试管中，加入0.5 mL Pratec HR-B溶液于样品中，将样品上样于德国Pratec公司生产的倍性分析仪，用流式细胞计数法测定葡萄叶片单个细胞核的DNA含量。测定结果由仪器直接绘制出DNA曲线图。根据测定结果，确定处理植株的倍性。

2 结果与分析

2.1 胚根和植株的形态变化 从图1可以看出，与对照相比，秋水仙素处理后胚根明显粗壮，根尖处由于受秋水仙素毒害而变褐；处理时长势较弱的种子根部甚至整个种子死亡。

由图2可看出，秋水仙素加倍后，植株在形态上发生了变化。正常二倍体植株的叶片颜色浅,叶缘锯齿较圆(图2a)；而秋水仙素加倍后的植株，叶片颜色为深绿色，叶缘锯齿尖，叶片裂刻加深，表面光滑而有光泽(图2b)。

2.2 葡萄植株的倍性鉴定 采用倍性分析仪对未经处理的未名玫瑰二倍体对照植株及采用秋水仙素处理的植株进行倍性分析，典型的二倍体、四倍体及二倍四倍嵌合体的DNA含量分布见图3。从图3可以看出，二倍体对照植株仅在峰值 50 的位置出现1 个单峰，四倍体植株在峰值100的位置出现 1 个单峰，而部分植株具有 2 个峰，除峰值50附近有 1 个峰外，在峰值100附近还有 1 个峰，如加倍成嵌合体植株的第 1 个峰值为 49.04，第 2 个峰值为 98.53，两者比值约为2，即为二倍体和四倍体的嵌合体，还有些植株在峰值约25处出现1个峰，此植株为单倍体植株。

图1 0.4%秋水仙素处理96 h(a)和清水处理(b)Fig.1 Treatment of 0.4% colchicine for 96 h (a) and clean water control (b)

2.3 不同浓度秋水仙素和不同处理时间对诱变效果的影响 从表1可以看出，随着处理浓度的增加和处理时间的延长，植株成活率逐渐降低。其中，在秋水仙素浓度为0.4%时，48 h成活率最高，72和96 h成活率差异不显著；但变异率和四倍体率较低。不同浓度秋水仙素处理成活率由高到低依次为①、④、⑦，其中，处理⑦、②和③差异不显著，处理⑤和⑧差异不显著。极差分析表明，处理时间的贡献率大于处理浓度，即处理时间对成活率的影响大于处理浓度对成活率的影响。变异率和四倍体率则随着处理时间的延长和处理浓度的增加而增加，变异率最高的是处理⑨，即浓度0.6%的秋水仙素处理96 h变异率最高(为7.63%)，其次是0.5%的秋水仙素处理96 h(变异率为6.37%)，变异率第3的是0.6%的秋水仙素处理72 h(变异率为5.76%)。极差分析表明，处理时间是影响变异率的主要因素。四倍体率最高的也是处理⑨，四倍体率从高到低依次为⑨、⑥、⑧、⑤，这与变异率不同；其中，处理⑨与⑥差异不显著。极差分析表明，处理时间是影响四倍体率的主要因素。综上所述，0.6%的秋水仙素处理96 h和0.5%的秋水仙素处理96 h未名玫瑰的发芽种子得到的四倍体后代最多，从成活率和四倍体率综合考虑，选取0.5%的秋水仙素处理96 h为未名玫瑰种子的最佳处理时间和处理浓度。

图2 对照二倍体未名玫瑰(a)和秋水仙素加倍后四倍体未名玫瑰(b)Fig.2 The control of diploid Weiming Meigui grape (a) and the tetraploid Weiming Meigui grape after processed by colchicine (b)

注：a.对照二倍体未名玫瑰，b.加倍为四倍体的植株，c.二倍体四倍体嵌合体，d.单倍体植株。Note:a.Diploid; b.Tetraploid; c.The chimera of diploid and tetraploid; d.Haploid.图3 DNA含量分布Fig.3 Distribution of DNA content

表1 不同浓度秋水仙素和不同处理时间对未名玫瑰诱变效果的影响

注：同列不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著。

Note:Different lowercases in the same column indicated significant difference at 0.05 level.

3 结论与讨论

陈俊等[7]用0.6 %的秋水仙素溶液在种子胚根长0.5、1.0、1.3 cm 时进行处理，结果发现，种子萌发后胚根长为1.0 cm 时诱导效果较好。该研究发现，当胚根长小于0.5 cm时耐药性较弱，种子根部褐化死亡；当胚根长1.0 cm时，其耐药性大大增强，根部褐化死亡的数量较少。这与陈俊等[7]的研究结果一致。因此，在选材时尽量用胚根长约1.0 cm进行处理。

常金华等[8]、杨晓明等[9]对染色体数目、气孔特征和花粉粒特性等与倍性有关的性状进行了鉴定，结果表明，这些方法操作复杂，且难度较大。倍性分析仪为植物染色体倍性的研究提供了一条便捷的途径，鉴定快速方便，且准确性较高[10]。笔者采用倍性分析仪分析细胞倍性，这与马爱红等[2]采用的方法相同，通过对诱变植株 DNA 含量变化进行鉴定，在短时间内可检测成千上万个细胞，除检测速度快外，还可检测生长点和叶片等非生长点部位，结果可靠全面，并具有一定的代表性。对于未名玫瑰种子,0.5%的秋水仙素处理96 h为最佳处理时间和处理浓度。

[1] 贺普超.葡萄学[M]. 北京:中国农业出版社，1999.

[2] 马爱红，范培格，孙建设，等.四倍体葡萄诱导技术的研究[J].中国农业科学，2005,38(8):1645-1651.

[3] DERMEN H. Colchiploidy in grapes[J]. The journal of heredity， 1954，45(4):159-172.

[4] 罗耀武，乔子靖，朱子英,等.人工诱变获得四倍体玫瑰香葡萄的研究[J].园艺学报，1997，24(2):125-128.

[5] 张淑爱，齐与枢， 魏宝发， 等. 用秋水仙素诱导葡萄试管苗获得多倍体[J].中国果树，1989(3):28-30，45.

[6] 卢炳芝，李佩芬，于向荣， 等.诱变葡萄体细胞胚获得同质四倍体植株的研究[J]. 果树科学，1997，14(3):145-148.

[7] 陈俊， 李登科， 李太宝， 等. 诱导葡萄多倍体研究[J].果树科学，1995，12 (3):151-155.

[8] 常金华,任清,罗耀武.人工诱变四倍体玫瑰香葡萄的倍性鉴定[J].核农学报,2003,17(3):221-224.

[9] 杨晓明`,王翠玲.葡萄多倍体诱导及其特征特性研究[J].甘肃农业大学学报，2005,12(6):741-474.

[10] 张俊娥，刘继红，邓秀新. 采用倍性分析仪鉴定柑橘愈伤组织的遗传变异[J].遗传学报，2003，30(2):169-174.

Identification and Induction of Weiming Meigui Grape with Colchicine

YAN Ai-ling1，2，WANG Hui-ling1，3，SUN Lei1，2，XU Hai-ying1*et al

(1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093; 2.Beijing Deciduous Fruit Tree Engineering Research Center，Beijing 100093; 3.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China)，Ministry of Agriculture，Beijing 100093)

[Objective] To research the optimal concentration and time of colchicine treatment for Weiming Meigui Grape，and the optimal ploidy identification method.[Method] With colchicine as the mutagenic agent，seeds were soaked in different concentrations of colchicine for different time，so as to induce theVitisvinifera.Cell DNA of the induced plants were identified by flow cytometry.[Result] Considering the induction survival rate and tetraploid mutation rate，the optimal condition for tetraploid induction (Weiming Meigui seeds) was when seed radical was 1 cm in length，it was treated by 0.5% colchicine for 96 h,the rate of tetraploid was 5.12% and the survival rate was 11.33%.[Conclusion]The ploidy analyzer is a simple,rapid method for determining cell ploidy.Treatment time is the main factor affecting the survival rate，tetraploid rate and mutation rate.

Grape (Vitisvinifera); Colchicines; Tetraploid; Analysis of ploidy

国家葡萄产业技术体系(CARS-30-YZ-3)。

闫爱玲(1972- )，女，新疆阿克苏人，副研究员，硕士，从事葡萄资源与育种研究。*通讯作者，研究员，硕士，从事葡萄育种研究。

2016-08-19

S 663.1

A

0517-6611(2016)28-0106-03