蛇龙珠等酿酒葡萄品种羧酸酯酶基因片段的SNP分析

陈小宇， 刘林德*， 葛宜和， 张 莉，李记明， 姜文广， 裴广仁

(1.鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025;2.烟台张裕集团有限公司，山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001)



蛇龙珠等酿酒葡萄品种羧酸酯酶基因片段的SNP分析

陈小宇1， 刘林德1*， 葛宜和1， 张 莉1，李记明2*， 姜文广2， 裴广仁2

(1.鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025;2.烟台张裕集团有限公司，山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001)

[目的]利用单核苷酸多态笥(SNP)分析蛇龙珠等酿酒葡萄的单核苷酸多态性及遗传亲缘关系，为今后研究酿酒葡萄的抗性机制以及培育抗病性葡萄提供参考。[方法]以酿酒葡蛇龙珠8个新株系(E01～E08)、品丽珠、 赤霞珠为材料，以欧亚种黑比诺为对照，对羧酸酯酶基因(CXEs)片段进行克隆和序列分析，研究蛇龙珠等酿酒葡萄之间的遗传差异。[结果]序列对比显示，该基因片段在编码区和非编码区均存在不同程度的碱基替换。11份葡萄材料的基因片段共发现87个多态性位点，平均74 bp左右的序列长度上能够检测到一个SNP位点，核苷酸多样度(Pi)0.050 76±0.011 49，单倍型多样度(Hd)1.000±0.039，表现出丰富的遗传多样性。3种中性检验方法比较序列变异模式，结果符合中性生化模型。通过聚类分析可将蛇龙珠E02、E03聚为一类，E07、E08聚为一类，其遗传距离和地理距离一致。该序列片段存在一些突变，这些突变能将蛇龙珠8个新株系与其他酿酒葡萄品种明显区分。[结论]CXEs基因片段的突变位点可作为遗传标记，利用SNP方法可分析葡萄的遗传多样性和亲缘关系。

蛇龙珠；羧酸酯酶；基因克隆；序列分析

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CXEs)是一种多功能酶，广泛存在于生物界中，能够催化各种水解反应[1]。羧酸酯酶的功能较多，在哺乳动物和昆虫体内分别参与药物的代谢和杀虫剂的代谢，在微生物中参与降解作用[2-3]。目前关于植物羧酸酯酶的研究较少。植物中的羧酸酯酶在代谢杀虫剂[4]和病原菌的致病过程中[5]起重要作用。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为第三代分子标记[6]，在遗传多样性分析[7]、遗传连锁图谱构建[8]、品种鉴定[9]以及性状的基因定位[10]等研究中应用广泛。近年来，欧洲酿酒葡萄的基因组框架图和全基因组测序的完成[11-12]，以及大量EST序列和cDNA序列的公布[13]，为从分子水平研究葡萄的遗传多样性提供了大量信息，同时也为葡萄CXEs基因的深入研究提供了条件。

葡萄是我国重要的栽培产物之一，葡萄病害严重影响葡萄的产量和品质[14]，培育抗病葡萄品种是葡萄育种的重要工作，羧酸酯酶在病原菌的致病过程中起重要作用。笔者通过对酿酒葡萄羧酸酯酶基因片段进行克隆和测序，利用SNP分析蛇龙珠等酿酒葡萄的单核苷酸多态性及遗传亲缘关系，为今后研究酿酒葡萄的抗性机制以及培育抗病性葡萄提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 酿酒葡萄8个蛇龙珠新株系(E01：蓬莱，E02：栖霞北，E03：栖霞南，E04：烟台市幸福街道；E05：莱山；E06：龙口；E07、E08：烟台开发区)，品丽珠、赤霞珠、黑比诺材料，由烟台张裕葡萄种质园提供。

1.2 葡萄总DNA的提取 采用Ezup Column Plant Genomic DNA Purification Kit提取基因组总DNA(Sangon,Biotech.Shanghai.Cat.:SK8262)，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，超微量分光光度计(P 300)检测DNA纯度和浓度。

1.3CXEs基因片段的克隆 扩增引物C4来自文献[15]，PCR 反应体系50 μL：10×Buffer 5 μL，Mg2+4 μL(25 mmol/L)，dNTPs 4 μL (2.5 mmol/L)，引物1.25 μL(10 μmol/L)，1 UTaq聚合酶，50 ng模板DNA。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳分离，凝胶成像系统下观察。PCR产物纯化回收后送至上海生工生物工程有限公司进行单向测序。

1.4CXEs基因片段的序列分析 将测序结果在NCBI上的BLAST程序与己登录的葡萄属植物进行同源性比对。利用BioEdit version 7.0.5软件进行人工调整，利用软件ClustalX 2.0将测序的11个样品进行序列比对，MEGA 5.0进行系统发育分析，采用邻接法(Neighbour Joining，NJ)构建系统发育树，以Bootstrap进行1 000次可信度分析。利用SNiPlay在线工具(http://sniplay.cirad.fr)对序列SNP出现的频率、突变位点以及多态性[16]进行分析，核苷酸多样度(Pi)、单倍型多样度(Hd)、中性检测运用DnaSP 5.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果 利用引物对11份葡萄材料的基因组总DNA进行PCR扩增，在600 bp附近得到1条明亮清晰的条带(图1)，测序后得到葡萄的CXEs基因序列。

2.2CXEs基因片段的序列比对及氨基酸序列比对 阳性克隆测序成功后，利用NCBI上的BLAST对目的片段进行同源性比对，结果显示其与已登录的葡萄属CXEs基因序列(基因登录号：XM_0106626666.1)的同源性高达99%，将目的片段产物的氨基酸序列进行同源性比对，结果显示其与已登录的葡萄属CXEs氨基酸序列(基因登录号：XP_010660968.1)的同源率高达94%，因此确定该段序列为CXEs基因中一段序列。

注：M.DL 10000 DNA marker；1～8.蛇龙珠E01～E08；9.品丽珠；10.赤霞珠；11.黑比诺。Note：M.DL 10000 DNA marker; 1-8.Cabernet Gernischt E01-E08;9.Cabernet Franc;10.Cabernet Sauvignon;11.Pinot Noir.图1 PCR纯化产物凝胶检测图谱 Fig 1 Gel electrophoresis of PCR purification products

注： *表示相似性100%。Note:*：100% identity on sequence.图2 CXEs基因片段序列比对Fig.2 The sequences alignment of CXEs gene segments

注：*表示该列残基完全一致，：表示该列仅包含非常保守的残基替换，.表示该列含有比较保守的残基替换。Note：* indicates exactly the column residues ,: indicates that the column contains very conservative residues，.indicates that the column contains relatively conservative residues.图3 CXEs基因片段氨基酸序列比对Fig.3 The amino acid sequence alignment of CXEs gene segments

CXEs基因片段的序列比对结果见图2，核苷酸序列有差异，将供试材料与NCBI上黑比诺的CXEs基因进行序列比对，在编码区和非编码区均存在不同程度的碱基突变。编码区在51～319 bp位置，非编码区的单核苷酸多态性位点明显多于编码区，包括碱基的颠换和转换，说明该区域的遗传多样性较丰富。

表1 CXEs基因序列的SNP特征

利用MEGA 5.2软件将测序所得的核苷酸序列转换成相应的氨基酸序列(图3)，经BioEdit version 7.0.5软件分析发现该基因片段起始密码子是ATG，位于51～53位核苷酸，终止密码子是TGA，位于317～319位核苷酸，开放读码框267 bp，编码89个氨基酸。蛇龙珠CXEs基因片段的非编码区氨基酸序列表现出较高的多态性。

2.3CXEs基因片段的SNP特征分析 11个样品的克隆片段大小在608～615 bp，其中，A含量在25.0%～26.6%，C含量在22.1%～23.3%，G含量在18.2%～19.2%，T含量在31.9%～33.9%。该基因片段共检测出11个二等位SNPs(表1)。基因突变类型包括基因颠换和基因转换，突变位点的等位基因大部分为纯合子。在这些二等位SNPs中，内含子区域7个，外显子区域4个，在外显子中有1处碱基突变使编码的氨基酸单核苷酸发生改变(Q/K)。

2.4CXEs基因片段的遗传多样性分析和中性检验 利用DnaSP 5.0软件将测序得到的核苷酸序列进行遗传多样性分析，结果表明，其多态性位点数87，突变位点数87，单倍型数量11，单倍型多样度(Hd)为1.000±0.039，核苷酸多样度(Pi)为0.050 76±0.011 49， Tajima′s D、Fu and Li′s D和Fu and Li′s F 3种中性检验均为正值(0.006 79、0.388 96、0.330 08)，且不显著，符合中性进化模型，说明这些葡萄样品未发生种群扩张。

2.5 进化树分析 采用MEGA 5.0软件中的NJ方法构建系统进化树(图4)，11个样品被分成2个分支，4个亚组。第一个分支包括黑比诺和赤霞珠。第二个分支包括2个亚组，品丽珠为第一亚组，来自不同地区的8个蛇龙珠聚为第二亚组。蛇龙珠与品丽珠关系较近，来自栖霞北的E02和来自栖霞南的E03聚为第一小分支，来自烟台开发区的E07和E08聚为第二小分支，来自龙口的E06、来自蓬莱的E01、来自烟台市幸福街道的E04、来自莱山的E05各为一小分支。来自相同地区的蛇龙珠E03和E02，蛇龙珠E07和E08各聚为一类，说明供试材料蛇龙珠8个新株系存在遗传变异和地理分化，遗传距离与地理距离一致。

图4 不同材料CXEs基因片段的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of CXEs gene from different samples

3 结论与讨论

基因序列数据库的获得促进除农作物SNP标记模型外其他植物的发展[17]。大量植物抗病基因已经被确定，其中大部分已经标记了SNP位点[18]。该研究中，该基因片段共发现87个突变位点，平均74 bp左右有1个SNP位点，SNP频率1.70%～29.00%，Velasco等[12]研究葡萄品种杂合子基因组的高质量共识序列，结果表明，在葡萄遗传连锁图谱中SNP频率为4.0%，黑比诺每100 bp有1个SNP位点。这可能是由于蛇龙珠经过长期的人工培育和自然选择，其基因组产生更多的SNP位点[19]。这些SNP位点对于遗传鉴定、遗传多样性分析和亲本鉴定具有重要作用。

该试验测序得到的CXEs基因片段的核苷酸序列有较大差异，共有11个二等位SNP位点，其中，非编码区有7个SNP位点，编码区有4个SNP位点，非编码区的单核苷酸多态性位点多于编码区，而在自花授粉的玉米和棉花的单核苷酸多态性研究中也得出了“非编码区的单核苷酸多态性位点多于编码区”的结论[20-21]。Dong等[17]研究11个欧亚种和5个欧美种的SNP特征,结果表明，基因转换70%，基因颠换20%。Yang等[22]通过计算机辅助分析表达序列标签(EST)研究番茄的SNP，结果表明，基因转换58.1%，基因颠换39.5%。而该试验得出基因转换的频率(71.8%)也高于基因颠换(20.7%)，与前人的研究结果一致。

通过CXEs基因片段序列差异性构建的系统进化树可以有效地将蛇龙珠8个新株系及品丽珠、赤霞珠和黑比诺进行聚类分析，且聚类分析和地理距离具有相关性；这些葡萄样品的CXEs基因片段Pi(0.050 76±0.011 49)高于王佳媛等[23]得出的凹叶木兰Pi(0.017 8)以及Zhu等[24]得出的大豆Pi(0.001 2)，Pi和Hd的数值越大，其多样性程度越高，遗传多样性越丰富，说明该基因片段具有较高的遗传多样性。综上所述，该基因片段可作为一种遗传标记用于鉴别葡萄的亲缘关系。植物在进化过程和多年栽培过程中发生变异引起个体之间的差异，这些差异决定植物的品种、特性等[25]。酯酶基因扩增及突变是酯酶参与抗性的主要方式[26]，今后可对抗性基因的单核苷酸进行关联研究，为分子标记辅助育种开发可利用的单核苷酸标记提供理论依据。

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The SNP Analysis of Carboxylesterases in Cabernet Gernischt (Vitis vinifera L.)and Other Wine Grape Cultivars

CHEN Xiao-yu1，LIU Lin-de1*，GE Yi-he,LI Ji-ming2*et al

(1.School of Life Science，Ludong University，Yantai，Shandong 264025;2.Shandong key Laboratory of Microbial Fermentation Technology of wine,Yantai Zhangyu Group Co. Ltd.,Yantai Shandong 264001)

[Objective] The aim was to analyze mononucleotide polymorphism and genetic relationships of Cabernet Gernischt (VitisviniferaL.)and other wine grape cultivars，provide reference for study on resistance mechanism of wine grape and cultivation of disease resistant grape.[Method] The difference among Carboxylesterase gene fragments was analyzed to investigate the genetic diversity of Cabernet Gernischt and other wine grape cultivars.Eight new strains of Cabernet Gernischt (E01-E08)，Cabernet Sauvignon，Cabernet Franc were used as experimental materials and Pinot Noir (V.vinifera) were taken as control materials，Carboxylesterase gene fragments were cloned and analyzed.[Result] The analysis of Carboxylesterase gene fragments sequence alignment showed that there were different degrees of base substitutions between the samples in the coding and non-coding regions.A total of 87 SNPs were detected in the sequenced fragments，a SNP locus was found on every 4 bp sequence on average.Nucleotide diversity (Pi) =0.050 76 (±0.011 49)，Haplotype diversity (Hd)=1.000 (±0.039) which give a high leve1 of polymorphism.Three neutrality tests were used to compare the patterns of sequence variations，the result indicates conform to neutral mutation.The clustering dendrogram was constructed by Neighbour Joining (NJ)，Cabernet Gernischt E02 (north of qixia) and E03 (south of qixia) classified into one group，E07(development zone) and E08 (development zone) classified into one group，genetic distance in accord with geographic distance.The results of the experiment showed that there were several mutations in the Carboxylesterase gene fragments might be selected to be the molecular marker to distinguish Cabernet Gernischt eight new strains and other wine grape varieties.[Conclusion]The mutation site of CXEs gene fragment can be used as a kind of genetic marker,SNP method can identify genetic relationships of grape.

Cabernet Gernischt; Carboxylesterase; Gene cloning; Sequence analysis

烟台市科技发展计划项目(2012JH204)；泰山产业领军人才工程专项；国家高技术研究发展计划项目(2013AA102108)。

陈小宇(1991- )，女，山东德州人，硕士研究生，研究方向:种群群落生态学。*通讯作者，刘林德，教授，博士，硕士生导师，从事种群生态学和遗传学研究；*通讯作者，李记明，研究员，博士，博士生导师，从事葡萄和葡萄酒方面的研究。

2016-08-11

S 188

A

0517-6611(2016)28-0109-05