不同pH条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG含量测定及分析

周红超+陈平+张建博+左晓霜+华杰+范源

摘要：目的测定不同pH条件下的五倍子中EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、EGC（表没食子儿茶素）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）的含量变化。方法应用反向高效液相色谱法，测定在超声1h条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸缓冲液（pH值分别为2、3、4、5、6、7、8）中的含量变化情况。结果EGCG在缓冲液pH值为2～5和6～8区间呈上升趋势，pH值为5～6区间呈下降趋势，且在pH值为8时含量最高；EGC在缓冲液pH值为2～4和7～8区间呈下降趋势，pH值为4～7区间呈上升趋势，且在pH为2时含量最高；ECG在缓冲液pH值为2～3和4～5区间呈下降趋势，pH值为3～4和5～8区间呈上升趋势，且在pH值为8时含量最高。结论五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH值条件下的含量有变化，反映了酸碱度对五倍子中EGCG，EGC，ECG含量变化的影响，本实验研究可为五倍子的理化性质研究以及质控标准等方面提供一定的参考。

关键词：RP-HPLC法；五倍子粉；EGCG；ECG；EGC；含量变化

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0078-03

五倍子是瘿绵蚜科（Pemphigidae）五节根蚜亚科（Fordinae）某些蚜虫寄虫瘿。五倍子别名文蛤，百虫仓，木附子等，是生在漆树科（Anacadiaceae）盐肤木属（Rhus L）几种树的复叶上形成的一类商品，五倍子有角倍类，肚倍类，花倍类。始载于《开宝本草》，具有敛肺降火，涩肠止泻，固精缩尿，止汗，止血，解毒，敛疮等多种临床功效，以它为原料的各种产品广泛应用于医药，冶金，食品航天等领域[1-3]。

五倍子主要有效成分为鞣质，又称鞣酸。因五倍子盛产于我国，国际上又将五倍子鞣质称为中国鞣质，它是倍酰葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酯类化台物的混合物，属可水解鞣质[4]。五倍子的鞣质含量很高，最高可达70%以上。1994年林余霖等[5]测定了7种五倍子中单宁酸的含量，角倍为4901%，肚倍为6475%圆角倍为6075%，其他几种均在40%左右。没食子酸也是五倍子中主要成分之一，在制药等工业上应用广泛，也是药物中间体，它的含量约占五倍子2%一4%[6]。由于含量小，工业上从五倍子获取的没食子酸主要通过五倍子鞣质的水解获得，它是我国的出口产品之一。五倍子中还含有五倍子油。五倍子油的主要化学成分为癸酸、月桂酸、内豆蔻酸、棕榈酸、硬腰酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等8种；五倍子中含有多种微量元素，包括铜、锌、铁、镁、钠、钙等的化合物；此外，五倍子中还有树脂、脂肪物质、淀粉、蜡质、蛋白质等其他成分。

五倍子中化学成分现已成为研究热点，李春远等[7]对五倍子的石油醚和氯仿提取物做了分离，一共获得10个化合物，分别为2-羟基-6-十五烷基苯甲酸、白果酚、棕榈酸-1，3-二甘油酯、β-谷甾醇、正二十五烷、3-甲氧基-4-羟基-苯甲酸、棕榈酸、月桂酸、肉豆蔻酸、没食子酸。而五倍子中EGCG，EGC，ECG报道较少。EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯），是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，是茶多酚生物活性的主要成份。纯品为白色粉末，味苦涩、无毒、极易溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯，不溶于氯仿。熔点218℃，在空气中易被氧化，变成微粉色，也容易随着温度的升高而被氧化。EGCG中含多个酚羟基，具有很强的抗氧化和清除自由基的能力[8]。EGC（表没食子儿茶素），别名：表没食子酸儿茶素；绿茶儿茶酚；L-表没食子儿茶精等。熔点208-210℃。储存温度2-8℃。EGC中的多酚结构与其抗氧化或促氧化作有关[9-10]。ECG（表儿茶素没食子酸酯）。分子式：C22H18O10。分子量44237[11-12]。纯品为白色粉末。储存温度2-8℃。酯型儿茶素ECG具有极强的抑菌活性，可能开发成一种天然的类抗生素物质[14]。本实验依据EGCG，EGC，ECG的理化性质，应用RP-HPLC测定在不同pH条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG的含量变化。

结构式：

1实验材料与仪器

11实验药品五倍子（角倍，购自昆明道地中药饮片厂 规格：饮片 批号：130801）；EGCG（道斯夫生物479-560-7）；ECG（中国药品生物制品检定所 1257-08-05）；EGC（上海锐谷生物科技有限公司970-74-1）。

12仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent1200 型 VWD检测器）；Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）。万分之一分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司制造）；精密pH测定仪（上海雷磁 PHS-3C型）；循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂 SHZ-DIII型）；高速多功能粉碎机（YB-500A型）；80目筛（5号筛180μm）；电热恒温干燥箱（DHG-9071A型）；超声仪（KUDOS型）；移液管；烧杯；玻璃棒；容量瓶；微孔滤膜（045μm）；注射器（1mL）；无水甲醇（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；冰醋酸（分析纯）；纯化水。

2实验方法

21磷酸盐缓冲液的配制A液：取磷酸10 mL，加纯化水至100 mL，摇匀。B液：称取磷酸氢二钠7163 g，加纯化水使溶解成100 mL。分别取上述不同体积的A 液和B液混合配制成不同pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸盐缓冲溶液，即得。

22对照品溶液的制备取EGCG标准品适量，于分析天平上精密称定，称得29 mg；取ECG标准品适量，于分析天平上精密称定，称得3 mg；取EGC标准品适量，于分析天平上精密称定，称得27 mg。分别置于10 mL容量瓶中，加纯净水定容至10 mL。在超声仪中超声溶解，通过045 μm滤膜注射至进样瓶并编号，即得。

23供试品溶液的制备取五倍子样品适量，敲开囊体，去除蚜虫尸体和蚜虫排泄物，用粉碎机粉碎，过80目筛，于电子天平上分别称取10 g五倍子粉末7份，置于试管中并编号（2，3，4，5，6，7，8），分别加入磷酸盐缓冲液（编号与pH值对应）20 mL，在超声仪中超声1h，用045 μm微孔滤膜抽滤，用1 mL注射器吸取适量对照品溶液，通过滤膜注射至进样瓶并编号，即得。

24色谱条件色谱条件为：Agilent C18色谱柱C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇：水：冰醋酸（25：74：1）混合液；温度25℃；流速：1 mL/min；波长270nm；进样量：10 uL；时间：30 min[14]。

25标准曲线的绘制

251EGCG标准曲线的绘制取EGCG适量于分析天平上精密称定360 mg，加色谱甲醇溶解配制成定容至10mL，用1 mL注射器吸取适量，通过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述EGCG色谱条件分别进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面积（Y）对标准品质量（X）进行线性回归，得方程Y=1387X+5172，r=1，结果表明：EGCG峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为：072μg-432 μg。

252EGC标准曲线的绘制取EGC适量于分析天平上精密称定300 mg，加色谱甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取适量，通过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述EGCG色谱条件分别进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGC的峰面积（Y）对标准品质量（X）进行线性回归，得方程Y=3573X+1019，r=09991，结果表明：EGC峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为：06 μg-36 μg。

253ECG标准曲线的绘制取ECG适量于分析天平上精密称定600 mg，加色谱甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取适量，通过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述ECG色谱条件分别进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面积（Y）对标准品质量（X）进行线性回归，得方程Y=1615X-1000，r=09996，结果表明：EGCG峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为：12 μg-72 μg。

26EGCG，EGC，ECG的含量测定分别取23项下方法制备的供试品溶液适量，按24色谱条件分别测定EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸盐缓冲液条件下的含量，用标准曲线法进行计算。

3实验结果与分析

31不同pH条件下EGCG，EGC，ECG 的含量变化

在缓冲液pH值为2～3的区间，随着pH的增大，EGC含量急剧下降；pH值为3～5的区间，随着pH的增大，EGC含量变化不明显；pH值为5～7的区间，随着pH的增大，EGC含量逐渐增加；pH值为7～8的区间，随着pH的增大，EGC含量缓慢下降，且当pH值为2时，在所测pH值范围中含量达到最高。如图2

在缓冲液pH为2～3的区间，随着pH的增大，ECG含量缓慢下降；pH值为3～4的区间，随着pH的增大，ECG含量缓慢增加；pH值为4～5的区间，随着pH的增大，ECG含量逐渐减少；pH值为5～6的区间，随着pH的增大，ECG含量逐渐增加，且当pH值为8时，在所测pH值范围中含量达到最高。如图3

EGC在pH值为2～3的区间呈明显下降趋势，在pH值为2时含量最高，但酸性强则EGCg，ECG含量较低，当pH值为7时，含量较高且酸碱度在中性；EGCG和ECG在pH值为5～8的区间呈上升趋势，且在pH值为8时两者含量都达所测范围的最高，酸碱度偏中性；在pH值为6～8的区间，EGCG，EGC，ECG含量都呈上升趋势，可能是由于偏碱、超声条件使其提取率增加，还需要做更深一步的研究。

4结论

五倍子中EGCG，EGC，ECG报道较少。通过测定EGCG，EGC，ECG在不同pH缓冲液中的含量，结果提示：五倍子在pH值为8的缓冲液中EGCG含量最高；五倍子在pH值为2的缓冲液中EGC含量最高；五倍子在pH值为8的缓冲液中ECG含量最高。本实验可以为五倍子进一步的理化性质研究以及质控标准等方面提供一定参考。参考文献：

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