脑脊液流式细胞术在儿童中枢神经系统白血病早期诊断中的意义

安美玉+陈芬

[摘要] 目的 探讨脑脊液流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）在诊断儿童中枢神经系统白血病（Central Nervous System Leukemia，CNSL）中的意义。方法 采用单克隆抗体双重直接免疫荧光素标记法对2015年1 月—2016 年3月期间该院收治的45例可疑中枢神经系统浸润患儿的脑脊液进行细胞免疫表型分析，同时进行脑脊液细胞形态学（Conventional Cytology，CC）检测，比较两种方法的差异。结果 45例患儿中，FCM有15例发现异常免疫表型，阳性率为33.33%，CC发现9例存在原始幼稚细胞，阳性率为20%，两者差异具有统计学意义（P<0.01）。结论 脑脊液FCM在儿童CNSL的诊断中具有重要的临床意义。

[关键词] 流式细胞术；细胞形态学；脑脊液；中枢神经系统白血病

[中图分类号] R725.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）10（b）-0042-03

[Abstract] Objective To evaluate the value of flow cytometric of cerebrospinal fluid cells in the diagnosis of central nervous system leukemia in children. Methods Used Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies，45 cerebrospinal fluid samples who had central nervous system involvement was analyzed with flow cytometric immunophenotyping and conventional cytology in January 2015 to March 2016，the results of flow cytometry were compared with conventional cytology. Results The results showed that 33.33% children had abnormal cells by flow cytometry and 20% children had abnormal cells by conventional cell morphology in 45 cases。The difference had statistical significance （P < 0.01）. Conclusion Flow cytometriy analysis of cerebrospinal fluid has important clinical significance in the diagnosis of CNSL in children。

[Key words] Flow cytometry；Conventional cytology；Cerebrospinal fluid；Immunophenotyping；Central nervous system leukemia

随着化疗方案的改进，我国儿童急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblastic leukemia，ALL）的疗效获得了显著改善，儿童ALL诱导缓解率高达91%～94%，5年无事件生存（EFS）率达70%～80%[1-3]。中枢神经系统白血病（Central Nervous System Leukemia，CNSL）是导致白血病化疗失败的主要原因之一，如何早期诊断CNSL具有重要意义。该文将对2015年1月—2016年3月期间45例急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的脑脊液进行分析，以研究脑脊液FCM在CNSL诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据2014年制定的儿童 ALL诊疗建议（第四次修订）为诊断标准[4]，以明确诊断急性淋巴细胞性白血病的患儿为对象，方便选取该院收治的临床疑似中枢神经系统浸润45例进行脑脊液CC及FCM检测。符合以下任何一项，并除外其他原因导致的枢神经系统病变时，列为可疑中枢神经系统浸润病例：①有神经系统症状；②脑脊液常规白细胞计数大于5×106 个/L时；③头颅核磁或CT提示影像学病变。

1.2 脑脊液细胞常规计数

将留取无菌新鲜脑脊液标本2 mL充入细胞计数板，高倍镜下计数有核细胞数。

1.3 脑脊液细胞学检查

吸取 2～3 mL脑脊液，标本离心后涂片，干燥后进行瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态，发现原始幼稚细胞则判定结果阳性。

1.4 FCM分析

采用单克隆抗体双重直接免疫荧光素（FITC/PE）标记法。留取2～3 mL新鲜脑脊液于无菌试管中，离心（1 400 r/min，5 min）后弃上清，留取100 μL，加入相应抗体，充分混匀，在室温、避光条件下孵育15 min，加入1 mL溶血素1 mL，混匀后避光，室温放置8 min，离心（1 400 r/min，5 min）弃上清，用PBS洗涤细胞，离心（1 400 r/min，5 min）后，弃上清，加入约3 mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入约100 μL PBS后，震荡混匀，立即上机检测。流式细胞仪及所有抗体来自美国BD公司。含六种荧光抗体标记：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。

1.6 统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计数资料以例数表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。阳性率指所检查标本中阳性结果所占比例。

2 结果

2.1 45例儿童ALL的临床特点

可疑中枢神经系统浸润者45例，所有病例均进行FCM及CC检测，其中男性28例， 女性17例， 年龄1～18岁，平均年龄（9.09±5.41）岁，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患儿有头痛、呕吐表现，44例患儿脑脊液常规白细胞计数≥5×106个/L，未发现头颅核磁及CT的影像学改变。两组检测方法在年龄、性别、免疫型、白细胞计数及神经系统症状方面，差异无统计学意义。见表1。

2.2 FCM与CC两种方法对45例ALL脑脊液异常细胞的检测结果

45例怀疑中枢神经系统侵润者的脑脊液细胞，其中FCM有15例发现异常免疫表型，其中B系6例，T系9例，阳性率为33.33%，CC发现9例存在原始幼稚细胞，其中B系3例，T系6例，阳性率为20%，两者检测方法的差异具有统计学意义（P<0.01）。见表2。

3 讨论

儿童CNSL发病率在2%～10%之间[5]，目前CNSL诊断金标准仍是脑脊液细胞形态学发现异常幼稚细胞，但脑脊液标本细胞数量少，离体环境下容易发生自溶，受主观经验性判断影响大，容易出现CNSL的误诊及漏诊，假阴性率高达20%～60%[6]，单纯依靠脑脊液细胞学检查并不能完全排除CNSL的诊断。FCM的细胞免疫分型是检测微量异常细胞非常敏感的方法，通过细胞表面标记片段确定各细胞群性质，受细胞形态变化影响小，亦不易受主观影响，能够准确的检测恶性肿瘤细胞，已广泛用于脑脊液检查中。

早期CNSL可无临床表现、影像学阳性发现，甚至脑脊液常规检查也无细胞数增高。蒋能刚等[7]报道，多参数FCM 分析在细胞数量较少情况下，显示出明显优越性。该次130例脑脊液中，发现1例细胞数为4×106 个/L的ALL（T系），CC-FCM+发现异常细胞群，异常细胞群占总细胞的54.14%，表达CD5。在45例怀疑CNSL的脑脊液中，15例诊断CNSL的病例中白细胞数在4～100×106个/L之间有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。脑脊液白细胞计数越高，形态学及FCM越容易发现异常细胞，其中细胞形态学更为明显。而脑脊液白细胞数少时，FCM相较于CC更敏感。此外，有报道指出[8]，当行FCM及CC检测时，CC容易受到FCM结果影响。该次研究也存在类似问题，有2例脑脊液发现FCM阳性结果后，CC更改了起初阴性结果的判读，可见，细胞形态学分析对于良恶性细胞的判断主观性仍较强。

脑脊液FCM在CNSL诊断中，具有很高的灵敏度和特异性。Mitri Z等[8]报道，脑脊液流式细胞术和CC的特异性均为100%，但前者的敏感性明显高于CC，接近100%。Ranta S等[9-11]研究显示，在高度怀疑中枢神经系统侵润的淋巴瘤中，FCM的CNSL检出率是细胞形态学的2～3倍。该研究对70例ALL患儿，共130例次脑脊液标本进行FCM及CC检测，其中45例怀疑有CNSL可能，CC阳性检出率为 20%（9/45），FCM的阳性检出率为33.33%（15/45），是CC检出率的1.67倍，与报道类似。建议对怀疑有中枢神经系统病变的患者，在进行脑脊液细胞形态学检测的同时，进行FCM的评估，以提高早期诊断CNSL的阳性率。

综上所述，脑脊液FCM 的阳性检出率及准确性明显高于传统脑脊液CC方法，对CNSL的诊断具有极大的应用价值，是诊断CNSL方法的重要补充。由于CNSL发病率较低，对于FCM及CC诊断的一致性仍需要今后大样本进一步研究论证。

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（收稿日期：2016-07-16）